外源精氨酸对不同诱导型一氧化氮合酶表达程度的胃癌细胞生长的影响

　　作者：康晴， 张更， 庄则豪 作者单位：福建医科大学 1.附属第一医院 营养科，福州 350005;2.基础学院 人体解剖教研室，福州 350004;3.附属第一医院 消化科，福州 350005

　　【摘要】 目的 探讨诱导型一氧化氮合酶(iNOS)表达与外源精氨酸补充对胃癌细胞生长的影响。 方法 RTPCR法检测胃癌细胞株SGC7901及MGC803中精氨酸酶Ⅰ、Ⅱ(AⅠ、AⅡ)及iNOS的mRNA表达，MTT法检测分别培养于富/无精氨酸培养基的SGC7901及MGC803胃癌细胞株的生长情况，及加入1 μmol/L NOS抑制剂L单甲基精氨酸 (LMMA)后的生长变化。 结果 iNOS在胃癌细胞株MGC803强表达，但在胃癌细胞株SGC7901表达极弱;2种细胞株AⅡ均强表达而AⅠ无表达。无论是否存在LMMA，富精氨酸培养条件下胃癌细胞株SGC7901的增殖均强于无精氨酸时 (P<0.05)，而在富/无精氨酸培养基中，是否加入LMMA均不影响胃癌细胞株SGC7901的增殖 (P>0.05)。无LMMA时，胃癌细胞株MGC803在富精氨酸培养条件下的增殖强于无精氨酸时 (P<0.05);在无精氨酸培养基中加入LMMA不影响细胞生长(P>0.05);但在富精氨酸培养基加入LMMA可显著促进胃癌细胞株MGC803生长(P<0.05)。 结论 外源精氨酸补充对iNOS高表达的胃癌细胞可能因iNOS产物的增加而产生细胞抑制作用，精氨酸耗竭策略可能更适合低表达iNOS的肿瘤细胞。

　　【关键词】 精氨酸; 一氧化氮合酶; 胃肿瘤; 肿瘤细胞，培养的

　　精氨酸是鸟氨酸循环中精氨酸酶完成氨解毒、合成多胺的唯一底物。精氨酸酶有2种亚型，Ⅰ型为肝精氨酸酶(hepatic arginase, AⅠ)，存在于肝细胞质;Ⅱ型为肝外精氨酸酶(extrahepatic arginase, AⅡ)，存在于线粒体基质。精氨酸同时也是一氧化氮合酶(nitric oxide synthase,NOS)合成NO的唯一底物[1]。在胃癌组织中，诱导型NOS(inducible nitric oxide synthase, iNOS)的高表达已为人所熟知，而高精氨酸酶活性亦很常见[25]。对不同乳腺癌细胞株的研究表明，精氨酸酶活性越高细胞增殖越快，而iNOS活性高时则相反，这主要是由于精氨酸酶高活性增加了细胞增殖所需的多胺合成，而iNOS活性高时增加的产物NO则明显抑制细胞生长[6]。为探讨这一现象是否同样存在于胃癌组织中，笔者检测不同iNOS表达程度的胃癌细胞株在富/无精氨酸培养基中的生长情况及与iNOS抑制剂L单甲基精氨酸(Lmonomethylarginine,LMMA)的关系，探讨iNOS表达与外源精氨酸补充对胃癌细胞生长的影响。

　　1 材料与方法

　　1.1 细胞培养 胃癌细胞株SGC7901及MGC803为福建医科大学神经解剖研究室保存。细胞复苏后，以含10%胎牛血清(杭州四季青生物工程材料研究所)、100 U/mL青霉素和100 μg/mL链霉素的RPMI1640培养基(美国Gibco公司)，37 ℃、体积分数为0.05的CO2恒湿培养箱培养。

　　1.2 方法

　　1.2.1 条件培养基 无精氨酸培养基为不加入精氨酸的RPMI1640培养基，富精氨酸培养基为加入2 mmol/L精氨酸的RPMI1640培养基。

　　1.2.2 RTPCR检测 不同细胞中，AI、AⅡ、iNOS以及βactin(内参照)的基因表达采用RTPCR方法。以Trizol(美国Life Technologies公司)法抽提总RNA，Superscript Ⅱ试剂盒(美国Invitrogen公司)合成cDNA。按说明书操作。PCR引物序列如下：

　　AI(278 bp)

　　上游：5’ATCACAGCAAACCGAACAGAAC 3’

　　下游：5’TTCCAACCGTGAGTTGACACTT3’

　　AⅡ(302 bp)

　　上游：5’G AGGCTTTCTATGTTGGGATGC3’

　　下游：5’CTGATACAGTGGTG AGGGGTGT3’

　　iNOS(324 bp)

　　上游：5’CCTTCAGGTATGCGGTATTTGG3’

　　下游：5’TGCTGAGAGCTTTGTTGAGGTC3’

　　反应条件分别为：AI，94 ℃ 30 s→62 ℃ 45 s→72 ℃ 45 s，28个循环;AⅡ，94 ℃ 30 s→58 ℃ 45 s→72 ℃ 45 s，30个循环;iNOS，94 ℃ 30 s→60 ℃ 45 s→72 ℃ 45 s，28个循环。βactin(490 bp)为参照。RTPCR分析重复3次，扩增产物用20 g/L琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像仪记录灰度，以目标基因产物与βactin的灰度比值(x±s)为mRNA相对表达量，结果取平均值。

　　1.2.3 MTT法检测细胞生长情况 胃癌细胞株SGC7901及MGC803于含10%FCS培养基的96孔板生长至50%～60%融合，分别加入最终浓度1 μmol/L的LMMA(美国Sigma公司)[7]。各设4组复孔。继续培养48 h，更换培养基，每孔分别加入0.5 g/L四甲基偶氮唑盐，37 ℃孵育6 h。弃培养基，加入DMSO甘油缓冲液，紫外分光光度计570 nm波长下记录吸光度。

　　1.3 统计学处理 采用SPSS 10.0统计分析软件。用KruskalWallis H检验，组间比较采用MannWhitney U检验。

　　2 结 果

　　2.1 AI、AⅡ及iNOS在2种胃癌细胞株中的mRNA表达 胃癌细胞株SGC7901及MGC803均有很强的AⅡ表达，iNOS在胃癌细胞株SGC7901表达极弱,而胃癌细胞株MGC803表达很强。2种胃癌细胞株均未检出AI表达(表1,图1)。表 1 2种胃癌细胞株中AⅡ及iNOS mRNA的表达

　　2.2 加入LMMA前后2种胃癌细胞株在富/无精氨酸培养基中的生长情况 胃癌细胞株SGC7901在富精氨酸培养条件下，生长均比无精氨酸培养基的旺盛，吸光度值有显著性差异(P<0.05);而在富/无精氨酸培养基中生长的胃癌细胞株SGC7901，在加入LMMA前后，其细胞生长情况并无明显不同，其吸光度值无显著性差异(P>0.05)。胃癌细胞株MGC803加入LMMA前，MGC803胃癌细胞株在富精氨酸培养基中比无精氨酸培养基的生长旺盛，吸光度值有显著性差异(P<0.05);在无精氨酸培养基中生长的胃癌细胞株MGC803加入LMMA前后，其细胞生长情况亦无明显不同，吸光度值无显著性差异(P>0.05);但在富精氨酸培养基中生长的胃癌细胞株MGC803，加入LMMA后细胞生长明显旺盛，吸光度值有显著性差异(P<0.05)(表2)。表 2 加入LMMA前后2种胃癌细胞株在富/无精氨酸培养基中的生长

　　3 讨 论

　　精氨酸是一种重要的氨基酸。精氨酸由精氨酸酶代谢为鸟氨酸和尿素，多胺则是由鸟氨酸合成的精氨酸酶次级产物。精氨酸酶的2种亚型中，与鸟氨酸、生物合成有关的主要是AⅡ。由于精氨酸同时也是iNOS合成NO的唯一底物，而NO和多胺对细胞增殖可能产生不同的影响，使得评价精氨酸在肿瘤生长中的作用变得十分复杂。iNOS与精氨酸酶具有共同的作用底物精氨酸，而其产物对细胞生长的影响完全不同，由于2种酶之间可能存在竞争性抑制，如果单独研究其中某一种酶的表达则很可能得到相互矛盾的结果，这可能也是目前对iNOS在肿瘤发展过程中作用的理解异质化的原因之一。本研究表明，AI在2种胃癌细胞株中均未检出表达，符合对该酶分布的认识;而在2种胃癌细胞株中均发现高表达的AⅡ。在富含精氨酸的培养基中，2种胃癌细胞株的生长均较无精氨酸培养基显著旺盛。提示高表达的AⅡ参与的精氨酸代谢是促进胃癌细胞生长的重要环节。

　　iNOS是合成NO的关键酶[8]。由于iNOS同时也利用精氨酸合成NO，在富精氨酸的培养基中，iNOS高表达的胃癌细胞应同时有较高水平的NO合成。在对乳腺癌细胞的研究发现，iNOS高表达细胞增殖速度减慢，并认为与iNOS活性高时催化产生的NO有明显的细胞生长抑制作用[6]。但是在本研究中，没有观察到iNOS高表达的胃癌细胞株MGC803在富精氨酸酶培养基中出现生长抑制，可能提示其高精氨酸酶表达对细胞生长的促进作用占优势。对低表达iNOS的胃癌细胞株SGC7901，无论在富精氨酸或是无精氨酸培养基中加入研究剂量LMMA对细胞的生长均不产生显著影响，提示此浓度的iNOS抑制剂本身无明显的细胞毒性作用，同样的情况也见于高表达iNOS、但培养于无iNOS作用底物(精氨酸)培养基中的胃癌细胞株MGC803。然而，在加入特异性的iNOS抑制剂LMMA后，高iNOS表达的胃癌细胞株MGC803在富精氨酸培养基中的生长较未加LMMA时明显旺盛，这一方面可能说明精氨酸酶可利用的作用底物增加，另一方面也可能提示iNOS催化产生的细胞抑制物NO减少，由于富精氨酸的培养基中使用的精氨酸量远超其AⅡ利用的饱和量，因此，观察到的活跃增殖现象应主要与iNOS产生的细胞抑制物质减少有关。

　　笔者认为，对iNOS高表达的胃癌细胞，富精氨酸补充可能因iNOS产物的增加而产生细胞抑制作用。尽管从本研究的观察不支持其起主导影响，但iNOS抑制剂可促进细胞增殖，因此，精氨酸耗竭策略可能对低表达iNOS的肿瘤细胞会有更好的抑制细胞生长效果。由于体外培养条件的局限性，本研究发现的这一现象还需在体研究的进一步观察。

　　【参考文献】

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