雷帕霉素、RAD001抑制胃癌细胞株MKN-28、MKN-45细胞生长的实验研究
发表时间：2010-10-14 浏览次数：371次
作者：朱祖安，刘莹，崔涛 作者单位：1.徐州医学院附属医院消化内科，江苏徐州221002; 2.徐州医学院病理学教研室，江苏徐州221002 江苏省教育厅自然科学基金(05KJD320234)
【摘要】 目的 探讨雷帕霉素(rapamycin)、RAD001(everolimus)对胃癌细胞株MKN-28、MKN-45细胞生长的影响,并对其机制进行初步探讨。方法 体外培养人胃癌MKN-28、MKN-45细胞，给予雷帕霉素、RAD001干预后通过细胞计数、流式细胞术检测肿瘤细胞生长、细胞周期分布情况。结果 雷帕霉素、RAD001均可抑制MKN-28、MKN-45细胞生长，抑制作用具有时间依赖性，雷帕霉素作用于MKN-28、MKN-45两种细胞株72 h抑制率分别为23.40%、36.26%;RAD001作用于MKN-28、MKN-45两种细胞株72 h抑制率分别为25.12%、40.11%。72 h时RAD001组与阴性对照组、DMSO对照组相比，MKN-28、MKN-45细胞计数差异有显著性(P<0.05)。RAD001作用24 h后MKN-28、MKN-45细胞周期发生改变，停滞在G0-G1期细胞比例增加。RAD001组与阴性对照组、DMSO对照组相比，MKN-45细胞周期差异有显著性(P<0.05)，MKN-28细胞周期差异无显著性(P>0.05)。结论 两种药物相比较，RAD001相对敏感;两株细胞相比较，MKN-45相对敏感。RAD001通过调节细胞周期进而抑制胃癌细胞的增殖。
【关键词】 胃肿瘤;哺乳动物雷帕霉素靶点; MKN-28;MKN-45;雷帕霉素;RAD001
An experimental study of the inhibitory effect of rapamycin and RAD001 on the growth of gastric carcinoma cell lines MKN-28 and MKN-45
ZHU Zu′an, LIU Ying, CUI Tao
1. Department of Gastroenterology, Affiliated Hospital of Xuzhou Medical College, Xuzhou, Jiangsu 221002, China;
2. Department of Pathology, Xuzhou Medical College, Xuzhou, Jiangsu 221002
Abstract: Objective To investigate the effect of rapamycin and RAD001 on the growth of gastric carcinoma cell lines MKN-28 and MKN-45 and to investigate its possible mechanism. Methods Gastric carcinoma cell lines MKN-28 and MKN-45 cultured in vitro were treated by rapamycin and RAD001 (20 nmol/L), and then the cell Coulter Counter and flow cytometry were used to detect cell growth and cell cycle. Results Both rapamycin and RAD001 could inhibit the growth of gastric carcinoma cell lines MKN-28 and MKN-45 in a time-dependence manner. The inhibition percentage of rapamycin at G2 phase (72 h) was 23.40% and 36.26%, and that of RAD001 at G2 phase was 25.12% and 40.11%, respectively. The cell counts of MKN-28 and MKN-45 in RAD001 group had significant differences compared with those in the negative control group and DMSO control group (P<0.05). At G0 phase or 24 h after RAD001 treatment, the cell cycles of MKN-28 and MKN-45 changed and the proportion of cells stagnating at G0-G1 increased. In RAD001 group, the difference in MKN-45 cell cycle was significant (P<0.05), while that in MKN-28 cell cycle was insignificant (P>0.05), as compared to the negative control and DMSO control groups. Conclusion Of the two drugs, RAD001 is more sensitive to MKN-28 and MKN-45, while of the two cell lines, MKN-45 is more sensitive to rapamycin and RAD001. The result suggests that RAD001 can inhibit the growth of gastric carcinoma cells by its adjustment to cell cycles.
Key words: stomach neoplasms; mammalian target of rapamycin; MKN-28; MKN-45; rapamycin; RAD001已换
我国胃癌的发病率、死亡率明显高于西方国家并呈逐年上升的趋势，每年新发胃癌患者40万人，死亡人数30万人。由于胃癌早期诊断困难，多数病例确诊时已属中、晚期，常伴有转移，所以临床治疗效果欠佳，因此有关胃癌治疗的研究更具有实际意义。哺乳动物雷帕霉素靶点(mammalian target of rapamycin，mTOR)又称FRAP、RAFT1、RAPT。mTOR 基因位于人常染色体1p36.2 上(Gene ID:2475)，编码全长2549个氨基酸、相对分子质量为289×103的mTOR蛋白。mTOR在细胞生长中处于核心地位，可在多种因素的活化下参与基因转录、蛋白质翻译起始、核糖体生物合成、细胞凋亡等多种生物学功能。另外，mTOR信号通路调控异常与肿瘤发生密切相关，是肿瘤治疗的一个重要靶点[1-2]。雷帕霉素(rapamycin)和RAD001(everolimus)为mTOR特异性抑制剂，本研究对雷帕霉素和RAD001作用于胃癌细胞株MKN-28、MKN-45后细胞生长的情况进行了观察和机制探讨。
1 材料和方法
1.1 实验材料
雷帕霉素、RAD001和胃癌细胞株MKN-28、MKN-45为奥地利大学临床药理学研究所Volker Wachek博士馈赠，雷帕霉素、RAD001用DMSO配成100 μmol/L、 1 mmol/L贮备液，实验时用RPMI 1640稀释为20 nmol/L。RPMI 1640、小牛血清均购自美国GIBCO公司，其他试剂均为分析纯级。细胞计数仪为美国Beckman公司产品，流式细胞仪为美国BD公司产品，电泳仪为美国Bio-Rad公司产品，碘化丙啶(PI)染液、RNase购自美国BD Bioscience公司。
1.2 方法
1.2.1 细胞计数及分组
取生长分裂期的MKN-28、MKN-45胃癌细胞用于实验，胰酶消化后置于24孔板内，每孔1×104个细胞，体积1 ml。待24 h细胞附壁后加入药物，每孔最终体积1.5 ml。实验分为对照组(RPMI 1640)、DMSO对照组、雷帕霉素组(20 nmol/L)，分别于用药后24、48、72 h用细胞计数仪进行细胞计数，整个实验重复3次。RAD001实验操作同上，实验分为对照组(RPMI 1640)、DMSO对照组、RAD001组(20 nmol/L)。每组平行样本6个。
1.2.2 细胞周期检测及分组
根据细胞计数结果选择对细胞较敏感药物RAD001作用于胃癌细胞株MKN-28、MKN-45进行细胞周期检测。取生长分裂期的胃癌细胞株MKN-28、MKN-45用于实验，常规胰酶消化后置于6孔板内，每孔1×105个细胞，体积5 ml。待24 h细胞附壁后移去所有上清，加入药物，每孔最终体积5 ml。实验分为对照组(RPMI 1640)、DMSO对照组、RAD001组(20 nmol/L)。于药物作用24 h收集细胞，流式细胞仪检测细胞周期，整个实验重复3次。每组平行样本3个。
1.3 统计学处理
实验数据以±s表示，使用美国国立图书馆Stata 10.0统计软件进行统计分析。细胞计数及细胞周期数据采用单因素方差分析， P<0.05认为差异有显著性。
2 结 果
2.1 雷帕霉素、RAD001对MKN-28、MKN-45生长的影响
2.1.1 雷帕霉素对胃癌细胞株生长的影响
雷帕霉素作用48 h即开始出现对胃癌细胞株生长的抑制作用，随着作用时间延长至72 h，抑制作用逐渐增强，MKN-28、MKN-45两种细胞株72 h抑制率分别为23.40%、36.26%，其中MKN-45相对敏感(表1、2)。阴性对照与DMSO对照组之间细胞计数差异无显著性(P>0.05)。表1 雷帕霉素对胃癌细胞株MKN-28细胞生长的影响(略)表2 雷帕霉素对胃癌细胞株MKN-45细胞生长的影响(略)
2.1.2 RAD001对胃癌细胞株生长的作用
RAD001作用24 h即开始出现对胃癌细胞株生长的抑制作用，随着作用时间延长至48 h、72 h，抑制作用逐渐增强，72 h时RAD001组MKN-28、MKN-45细胞株与阴性对照、DMSO对照相比细胞计数减少(P<0.05)。MKN-28、MKN-45两种细胞株72 h抑制率分别为25.12%、40.11%，其中MKN-45相对敏感(表3、4)。阴性对照组与DMSO对照组之间MKN-28、MKN-45细胞计数差异均无显著性(P>0.05)。表3 RAD001对胃癌细胞株MKN-28细胞生长的影响(略)表4 RAD001对胃癌细胞株MKN-45细胞生长的影响(略)
2.2 细胞周期的改变
RAD001作用24 h后MKN-28、MKN-45的细胞周期均发生改变，停滞在G0-G1期的细胞比例均增加，RAD001组与阴性对照组、DMSO对照组相比MKN-28细胞周期差异无显著性(P>0.05，表5);MKN-45相对敏感，RAD001组与阴性对照组、DMSO对照组相比细胞周期差异有显著性(P<0.05，表6)。阴性对照组与DMSO对照组之间MKN-28、MKN-45的细胞周期差异均无显著性(P>0.05)。表5 RAD001对胃癌细胞株MKN-28细胞周期的影响(略)表6 RAD001对胃癌细胞株MKN-45细胞周期的影响(略)
3 讨 论
在细胞内，mTOR最主要的功能是调控蛋白质合成，进而调控细胞的生长和增殖。 mTOR通过调控下游真核起始因子4E(eIF-4E) 结合蛋白1 (4E-BP1) 和p70S6K核糖体40S小亚基S6K蛋白激酶 (p70S6K)，分别调节真核生物转录延伸因子(eukaryotic elongation factor 2, eEF2)、核糖体40S小亚基S6蛋白从而调控着翻译过程[1];通过上游LKB1/AMPK/mTOR通路参与细胞能量代谢，调节细胞生长[3];另外，mTOR可通过PI3K/mTOR/HIF-1通路刺激血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF), 诱导血管生成，促进肿瘤的侵袭和转移[4]。
在胃癌细胞的分裂与生长过程中，mTOR途径扮演着重要角色，例如超过60%的胃癌组织中均可发现与mTOR密切相关的PTEN(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten)、p53丧失现象，而PTEN、p53的缺失可导致Akt被组成性的激活及mTOR 的过度活化，进而加快细胞周期等调控，影响肿瘤的进展及对化疗药物的敏感性[5-8]，而这个过程却可以被mTOR 特异性抑制剂所抑制。
针对mTOR的特异性抑制剂雷帕霉素的研究较多，该药除了作为免疫抑制剂外，还对白血病、卵巢癌、乳腺癌、小细胞肺癌有效，目前已开始临床试验。RAD001为雷帕霉素类似物，同样可以与mTOR的FKBP12蛋白结合位点(FKBP12-rapamycin binding, FRB domain)结合形成复合物后起到抑制作用，亦为mTOR的抑制剂。对于RAD001的研究目前国内较局限于其作为免疫抑制剂在器官移植方面的应用，对于肿瘤的研究目前国内主要见于肾癌及乳腺癌。本实验中体外培养MKN-28、MKN-45后给予雷帕霉素、RAD001，结果显示雷帕霉素作用48 h开始出现对胃癌细胞株生长的抑制作用，抑制作用具有时间依赖性，MKN-28、MKN-45两种细胞株72 h抑制率分别为23.40%、36.26%。RAD001作用24 h即开始出现对胃癌细胞株生长的抑制作用，抑制作用亦具有时间依赖性，MKN-28、MKN-45两种细胞株72 h抑制率分别为25.12%、40.11%。提示雷帕霉素和RAD001均可抑制胃癌细胞株生长，两种药物相比较，RAD001相对敏感;两株细胞相比较，MKN-45相对敏感。
为进一步探讨其作用机制，我们在实验中体外给予RAD001作用于MKN-28、MKN-45细胞后检测细胞周期的改变。结果显示，RAD001作用24 h后MKN-28、MKN-45细胞株细胞周期均发生改变，停滞在G0-G1期细胞比例增加，其中MKN-45相对敏感。提示RAD001通过调节细胞周期进而抑制胃癌细胞的增殖，mTOR有望成为胃癌治疗的分子靶点。但此实验仅为体外实验的一部分，继续探讨RAD001作用后调节细胞周期的机制将是进一步研究的方向。
【参考文献】
[1]Fingar DC, Blenis J. Target of rapamycin (TOR): an integrator of nutrient and growth factor signals and coordinator of cell growth and cell cycle progression [J]. Oncogene, 2004, 23 (18):3151-3171.
[2]潘智，张令强，蒋继志，等. mTOR的研究进展[J]. 细胞生物学杂志,2006, 28: 395-398.
[3]郑杰. mTOR信号途径与肿瘤[J].生命科学, 2006,18(3): 261-265.
[4]Jiang BH, Liu LZ. Role of mTOR in anticancer drug resistance: perspectives for improved drug treatment [J]. Drug Resist Updat, 2008, 11(3):63-76.
[5]Byun DS, Cho K, Ryu BK, et al. Frequent monoallelic deletion of PTEN and its reciprocal association with PIK3CA amplification in gastric carcinoma [J]. Int J Cancer, 2003, 104(3):318-327.
[6]Ang KL, Shi DL, Keong WW, et al. Upregulated Akt signaling adjacent to gastric cancers: implications for screening and chemoprevention [J]. Cancer Lett, 2005, 225(1):53-59.
[7]Velho S, Oliveira C, Ferreira A, et al. The prevalence of PIK3CA mutations in gastric and colon cancer [J]. Eur J Cancer, 2005, 41(11):1649-1654.
[8]Kobayashi I, Semba S, Matsuda Y, et al. Significance of Akt phosphorylation on tumor growth and vascular endothelial growth factor expression in human gastric carcinoma [J]. Pathobiology, 2006, 73(1):8-17.
