人胃腺癌细胞株AGS、SGC-7901增殖诱导配体mRNA的表达

　　作者：毛振彪 作者单位：南通大学附属医院消化内科，南通226001

　　【摘要】 目的：比较人AGS、SGC-7901两种胃癌细胞株中增殖诱导配体(APRIL) mRNA的表达水平。方法：通过半定量RT-PCR检测APRIL mRNA，筛选出APRIL mRNA高表达细胞株。结果：以GAPDH为内参，通过计算机图像扫描系统分析各株细胞APRIL mRNA的表达量,获得人胃腺癌细胞株APRIL mRNA表达量的相对值，AGS 0.09，SGC-7901 0.61。结论：SGC-7901为APRIL mRNA高表达细胞株。

　　【关键词】 胃腺癌 聚合酶链反应 增殖诱导配体

　　APRIL mRNA expression of human’s stomach adenocarcinoma cell line AGS and SGC-7901

　　MAO Zhenbiao, WANG Weiyi, HUANG Jiefei, et al (Department of Digestive Medicine, Affiliated Hospital of Nantong University, Nantong 226001; 1Biochemical Department, School of Life Science, Fudan University)

　　[Abstract] Objective: To detect the expression of human’s stomach adenocarcinoma cell line’s APRIL in the mRNA level by semi-quantitaive RT-PCR. Methods: We detected the expression of APRIL mRNA in stomach adenocarcinoma cell line (AGS and SGC-7901) by RT-PCR, and then selected high-level expression cell line. Results: Using by the image scanning system， GAPDH as the internal control, we get the relative value of AGS 0.09，SGC-7901 0.61.Conclusion: Selecting high-level expression APRIL mRNA cell line in stomach adenocarcinoma by semi-quantitative RT-PCR, it does play a fundamental role in the research for molecular mechanism for stomach cancer developing and metastasizing.

　　[Key words] Stomach adenocarcinoma; Polymerase chain reaction; A proliferation-inducing ligand

　　增殖诱导配体(a proliferation-inducing ligand，APRIL)是肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF)超家族的成员之一[1，2]。主要通过靶细胞表面的两个受体——穿膜蛋白活化物(TACI)和B细胞成熟抗原(BCMA)结合，从而促进肿瘤细胞的增殖，调节体液免疫，并参与B、T淋巴细胞增殖和活化[3~8]。已有研究证实APRIL在体内和体外均能刺激肿瘤细胞生长，说明它与肿瘤生长的调节关系密切[3]。我们研究发现APRIL在胃癌病变演变过程中呈现累积和渐进趋势。提示APRIL在胃癌发生、发展过程中可能起重要作用，但其分子机制还有待进一步研究证实。本研究采用半定量RT-PCR技术从2株胃腺癌细胞株中筛选出APRIL基因高表达细胞株，为进一步了解它在胃腺癌发生、发展过程中的作用及其分子机制等研究奠定实验基础。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料 (1)细胞株及培养液：胃腺癌细胞株AGS、SGC-7901和胰腺癌细胞株CFPAC-1(中科院上海生科院细胞资源中心)，DMEM、IMDM 、RPMI 1640和Ham’s F12k细胞培养基(美国Invitrogen公司)，新生牛血清和胎牛血清(Hyclone公司);(2)主要试剂和仪器：TRIzol(Invitrogen公司)，TaKaRa逆转录试剂盒、Taq聚合酶、限制性内切酶(TaKaRa生物技术公司，大连)，XP Thermal cycle PCR仪(杭州博日)，Queue Stabil-Therm 37℃ 恒温孵育箱(Revco Technologies USA);(3)引物：根据GenBank APRIL基因序列(NM 003808.2)和磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)基因序列(NM002064)，利用VECTOR NTI软件，设计引物，并由上海申能博彩生物工程公司合成。序列

　　APRIL1-F:5'–TCCGATGTGACAGAGGTGATG-3',

　　APRIL1-R:5'-AATGGAAGACACCTGCGCTAT-3';

　　APRIL2-R:5'-GCATACTTCTTATACATCGGAATAG-3';

　　GAPDH-F:5'-TTAGCACCCCTGGCCAAGG-3',

　　GAPDH-R:5'-CTTACTCCTTGGAGGCCATG-3'。

　　1.2 方法

　　1.2.1 细胞培养 分别用含10%胎牛血清的DMEM、IMDM 、RPMI 1640、Ham’s F12k和RPMI 1640培养液，单层培养CFPAC-1、胰腺癌细胞株和AGS、SGC-7901胃腺癌细胞株于37℃、5%CO2饱和湿度恒温孵育箱内，以0.25%胰蛋白酶传代消化。

　　1.2.2 RNA提取和RT-PCR反应 细胞株单层培养贴壁生长达90%时，0.25%胰蛋白酶消化搜集细胞，以106个肿瘤细胞加1ml TRIzol提取细胞总RNA，核酸蛋白紫外分析仪(岛津公司)检测RNA的质量和浓度。取总RNA 1μg进行逆转录反应(按说明书操作进行)，42℃ 1h，95℃ 15min灭活逆转录酶，cDNA分装置-20℃保存。将各细胞株等比例混合的cDNA为模板，取0.5μl在25μl PCR反应液(含1×PCR Buffer，0.3mmol/L dNTPs ，APRIL1号上下游引物和GAPDH上下游引物分别为0.6μmol/L和0.08μmol/L，TaKaRa Taq DNA 聚合酶0.5U)中进行PCR反应，并以无菌水为模板作空白对照。各反应管于XP Thermal cycle PCR仪进行PCR：95℃预变性30s，然后94℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 35s选取最佳PCR循环数，72℃延伸7 min，4℃维持。

　　1.2.3 玻璃粉法回收DNA PCR产物1.5%琼脂糖凝胶电泳，将目的片段从胶上割下置离心管中，加入16mol/L NaI 200μl 55℃温浴5min溶解，再加入1×TE(pH8.0)的玻璃粉溶液10μl，冰浴10min(每隔3min吹打1次)，离心去上清液，加入200μl New wash液(无菌水、乙醇、NaCl)吹打均匀后离心10s去上清，这样重复2次后55℃烘干，加入1×TE 10μl吹打均匀后55℃加热3min，离心5min取上清置另一Eppendorf管-20℃保存。

　　1.2.4 酶切鉴定 以引物APRIL 1-F和APRIL 1-R扩增APRIL基因第391~655位长度265bp片段。在APRIL基因第391~655位中含Xho I酶切位点，Xho I限制性内切酶0.5μl每10μl体系，37℃酶切APRIL扩增片段3h，琼脂糖凝胶电泳观察条带。

　　1.2.5 套式PCR鉴定 对扩增片段琼脂糖凝胶电泳割胶回收作为模板,以APRIL 1-F和APRIL 2-R为引物PCR扩增第391~601位长度210bp的片段，1.5%琼脂糖凝胶电泳观测结果。

　　1.2.6 半定量PCR循环数确定及半定量PCR 为了解各细胞株APRIL表达高低情况，需要在内参GAPDH基因片段扩增产物浓度一致的情况下，比较APRIL基因片段扩增产物浓度的高低。所以在其他条件(反应液成份、退火温度、延伸时间)一致情况下，通过观察PCR从27~33个循环GAPDH片段扩增产物浓度变化，确定其PCR反应的平台期，确定观察各细胞株APRIL表达高低的最佳循环数。根据PCR循环数摸索确定的最佳循环数，以各细胞株的cDNA为模板同时PCR扩增GAPDH和APRIL(同步骤1.3.1)，1.5%琼脂糖凝胶电泳后，通过计算机图像扫描系统检测获得各细胞株APRIL表达量的相对值，根据该值确定APRIL高表达肿瘤细胞株。

　　2 结 果

　　2.1 总RNA的质量和纯度及PCR扩增产物检测 以cDNA为模板，APRIL1-F、APRIL1-R和GAPDH-F、GAPDH-R两对引物，在同一PCR管里扩增应得265 bp、和540 bp大小的目的片段，经1.5%琼脂糖凝胶电泳，结果显示扩增出的目的片段大小与预期值相符合(见图1)。

　　2.2 PCR产物鉴定 APRIL引物扩增片段经XhoI限制性内切酶酶切后电泳显示较APRIL片段小，约150 bp大小片段(见图2);APRIL1-F和APRIL2-R为引物，以回收的265 bp大小APRIL片段为模板，PCR扩增391~601 bp长度210 bp的APRIL片段，经1.5%琼脂糖凝胶电泳，结果显示扩增出的目的片段大小与预期值相符合(见图3)。

　　2.3 半定量PCR最佳循环数的确定及PCR半定量 以混合的cDNA为模板，APRIL1-F、APRIL1-R和GAPDH-F、GAPDH-R两对引物同时扩增，在其他条件一致情况下，27~33个循环的PCR，电泳结果显示扩增出的GAPDH和APRIL片段条带亮度随循环数的增加而增加，第31循环时GAPDH的PCR反应进入平台期，APRIL的PCR产物从第31循环开始已比较明显(图1)。于是确定在第31循环对各细胞株APRIL表达进行半定量PCR。选取最佳PCR循环数，对各株细胞同时扩增GAPDH和APRIL基因片段。通过计算机图像扫描系统分析各株细胞的APRIL mRNA的表达量,AGS：0.09，SGC-7901：0.61。结果显示在人胃腺癌细胞株中，SGC-7901 的APRIL mRNA水平表达相对较高(见图4、5)。

　　3 讨 论

　　TNF及其受体超家族通过诱导多种生物学效应，如细胞的增殖、分化及凋亡等，在机体的防御、炎症反应、免疫调节等过程中起重要作用 。APRIL是TNF超家族的成员之一，首先由Hahne等[1]发现并克隆成功，全长250个氨基酸，其编码基因位于染色体17p13.1。研究发现， APRIL具有独特的促进肿瘤细胞增殖的生物学效应。APRIL mRNA在许多人类肿瘤细胞株(结肠癌细胞株SW480、肺癌细胞株A459、黑色素瘤细胞株G361等)和肿瘤组织(结肠癌、胃癌、食管癌等)中高表达，外加的低浓度重组APRIL能刺激体外培养多种人类肿瘤细胞株的增殖，转染APRIL基因到NIH-3T3后裸鼠移植瘤肿瘤生长速度明显高于NIH-3T3裸鼠移植瘤。这些证据充分说明APRIL在肿瘤发生过程中扮演自分泌生长因子的角色。APRIL作为一种细胞因子，在对靶细胞发生作用时，必须与其特异性受体结合，进而引起细胞内一系列反应。

　　人胃腺癌细胞株是否存在APRIL基因表达国内外鲜有报道。我们利用半定量RT-PCR对两株胃癌细胞株(AGS和SGC-7901)APRIL mRNA表达量的高低进行筛选。扩增GAPDH和APRIL基因片段琼脂糖电泳后,依次通过酶切鉴定、套式PCR鉴定，最后通过计算机图像扫描系统分析各株细胞的APRIL mRNA的表达量,获得各细胞株APRIL mRNA表达量的相对值，AGS 0.09，SGC-7901 0.61。结果显示在胃腺癌细胞株中，SGC-7901 的APRIL mRNA水平表达相对较高。通过筛选表达APRIL人胃腺癌细胞株，为下一步研究APRIL基因在胃癌发生、发展中内在机制及其信号传导通路奠定基础。

　　【参考文献】

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