pAKT、HIF-1α在胃癌中的表达及与血管生成的关系

　　作者：顾晓萌　卢雪峰　王慧　付金栋　季锐　姜大磊　雒燕 作者单位：1山东大学齐鲁医院　消化科　(山东　济南　250012) 2首都医科大学附属北京友谊医院　消化科　(北京　100050)

　　【摘要】目的: 研究磷酸化丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(pAKT)、缺氧诱导因1α(HIF-1α)在胃癌中的表达及AKT/HIF-1α途径与胃癌的发生和血管生成的相关性。方法: 免疫组化法检测64例胃癌及26例癌旁正常组织中pAKT蛋白和HIF-1α的表达，以CD34标记血管内皮,计数微血管密度(MVD)。结果: 64例胃癌组织中pAKT呈阳性表达48例(75%)，HIF-1α阳性表达42例(65.6%)，均显著高于癌旁组织(χ2分别为26.936、15.950，P<0.05);pAKT、HIF-1α表达与肿瘤的TNM分期、浸润深度、淋巴结转移、远处转移显著相关(P<0.05)。胃癌及癌旁组织MVD分别为43.5±12.7、26.2±12.3， P<0.05(t=5.614); pAKT、HIF-1α均阳性患者MVD显著多于pAKT、HIF-1α均阴性者(t=3. 947,P<0.05),pAKT与HIF-1α的表达呈正相关(Pearson r=0.583，P<0.05)。结论：pAKT蛋白过表达于胃癌组织，AKT蛋白的磷酸化可增强胃癌细胞的侵袭能力，促进胃癌的转移,又可以通过调节HIF-1α的表达促进胃癌新生血管的生成。同时检测胃癌组织中pAKT、HIF-1α和MVD的表达状态，对于胃癌的早期诊断和治疗有重要的指导价值。

　　【关键词】 缺氧诱导因子1α· 磷酸化丝氨酸/ 苏氨酸蛋白激酶·胃肿瘤·微血管密度

　　Relationship between pAKT, HIF-1α expression and angiogenesis in gastric cancer

　　GU Xiao-meng1, LU Xue-feng1, Wang Hui2, FU Jin-dong1, JI Rui1, JIANG Da-lei1, LUO Yan1

　　1Department of Digestive medicine, Qilu Hospital of shandong University (Jinan 250012, China)

　　2Department of Digestive medicine，Beijing Friendship Hospital of capital medical University (Beijing 100050, China)

　　【ABSTRACT】 Objectives: To investigate the expression of pAKT and HIF-1α and to analyze the relationship among AKT/HIF-1α pathway, the angiogenesis and carcinogenesis in human gastric carcinoma. Methods: The expression of pAKT and HIF-1αin 64 gastric carcinomas and 26 normal tissues were evaluated by immunohistochemistry. CD34 immunostaining was used to measure the microvascular density (MVD). Results: pAKT-positive expression was detected in 75% (48/64) of the tumors, HIF-1α-positive expression was 65.6%. The expression levels of pAKT and HIF-1α proteins in cancerous tissues were higher than those in normal tissues (P<0.05). The expression levels of pAKT or HIF-1α were significantly associated with TNM stage, invasion depth, lymph node metastasis or distant metastases (P<0.05). MVD of gastric cancer (43.5±12.7) was much higher than that of normal tissues (26.2±12.3), MVD was much higher in tumor with pAKT(+) /HIF-1α(+) than those in tumor with pAKT(-)/HIF-1α(-) (t=3.947, P<0.05), pAKT expression was significantly correlated with HIF-1α(r=0.583, P<0.05). Conclusion: pAKT is distinctively over expressed in gastric tissues and its phosphorylation may promote the invasion and metastases of gastric cancer. Additionally, it may increase the expression of HIF-1α to promote angiogenesis. Testing the expression of pAKT, HIF-1α and MVD simultaneously may help to early diagnosis and treatment for gastric cancer.

　　【KEY WORDS】 Hypoxia inducible factor 1 α· Phospho-serine/threonine protein kinase·Gastric cancer· Microvascular density

　　丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(AKT)是一种调节细胞增殖、分化、迁移中具有重要作用的蛋白激酶，处于PI3K/ AKT信号转导通路的核心部位，可在PI3K作用下生成磷酸化AKT(phosphorylated AKT, pAKT)而激活。pAKT又进一步激活下游因子，参与蛋白质合成、抗凋亡等过程,从而促进细胞的生长和增殖[1]。缺氧诱导因子1α(hypoxia inducible factor 1α, HIF-1α)是机体维持氧自稳平衡的核心调控因子，可调控一系列缺氧诱导基因的的表达。缺氧以及非缺氧刺激可通PI3K/AKT (protein kinase B,PKB)依赖或相关的途径诱导HIF-1α的表达和活性[2]。2006年5月～2006年7月我们通过检测研究pAKT、HIF-1α在胃癌中的表达，探讨AKT/HIF-1α途径与胃癌的发生及血管生成的关系。

　　1　资料与方法

　　1.1　研究对象　收集2005年7月～2006年6月于山东大学齐鲁医院经病理确诊的胃癌标本64例及其癌组织和癌旁3cm外正常组织标本26例，4%多聚甲醛固定，常规脱水，石蜡包埋，连续4μm厚切片。64例取标本前均未接受放化疗,其中男44例，女20例;中位年龄58.3岁。

　　1.2　主要试剂及检测方法　1∶100兔抗人pAKT单克隆抗体(Cell Signaling公司),1∶50鼠抗人HIF-1α单克隆抗体(Neomakers公司)，1∶40鼠抗人CD34单克隆抗体(北京中杉公司)、通用型抗人S-P免疫组化试剂盒(北京中杉公司)。以PBS代替一抗作为阴性对照，以已知阳性切片作为阳性对照。以前述一抗稀释浓度染色，操作步骤按试剂盒说明书S-P法进行。

　　1.3 免疫组化结果判定标准 光镜下以胞质内棕黄色细颗粒为pAKT蛋白表达阳性;胞核及胞质内棕黄色颗粒为HIF-1α蛋白表达阳性。高倍镜下(400倍)对每张切片随机选择5个视野，每个视野计数200个细胞，共计1000个。阳性细胞数<10%为(-)，阳性细胞数≥10%为(+)。MVD测定参照Weidner[3]方法:呈现棕色单个内皮细胞或内皮细胞群均为1个血管计数，但肌层较厚及管腔面积>8个红细胞直径的血管不计数。每张切片在100倍光镜下挑选血管分布最高区域，在200倍视野下计数5个视野中被CD34染成棕黄色的血管数目，取其平均值为微血管密度(MVD)。

　　1.4　统计学处理　数据用x±s表示。应用SPSS11.5软件对数据进行χ2 检验、成组设计t检验及Pearson相关分析。P<0.05为差异有统计学意义。

　　2　结果

　　2.1　胃癌及癌旁组织中pAKT、HIF-1α蛋白的表达及MVD值　阳性细胞主要为肿瘤细胞，坏死边缘的瘤细胞阳性表达尤为强烈。(见图1～5)。胃癌组织中pAKT表达阳性率为75%(48/64);癌旁组织中为15.4%(4/26),胃癌组织中pAKT的表达明显高于癌旁组织(P<0.01);胃癌组织中HIF-1α表达阳性率为65.6%(42/64)，癌旁组织中为HIF-1α阳性表达率为19.2%(5/26),胃癌组织中HIF-1α表达明显高于癌旁组织(P<0.01); pAKT与HIF-1α表达一致符合率为54.7%(35/64) ,两者表达呈显著相关(Pearson r=0.583,P<0.05)。CD34阳性表达主要见于癌组织血管内皮细胞胞质中,呈棕黄至棕褐色染色，胃癌组织MVD值显著高于癌旁组织(P<0.05)。详见表1。

　　2.2　pAKT、HIF-1α蛋白表达与胃癌的关系 pAKT、HIF-1α蛋白阳性表达率与患者的年龄、性别、肿瘤大小、分化程度无关(P>0.05);与胃癌浸润深度、TNM分期及有无淋巴结转移及远处转移显著相关(P<0.05)。详见表2。

　　2.3 　胃癌组织中的pAKT与HIF-1α蛋白与MVD关系 pAKT、HIF-1α蛋白表达阳性的组织与其表达阴性者的MVD值比较,有显著性差异(P<0.05 )，pAKT和HIF-1α蛋白均阳性的胃癌组织与pAKT、HIF-1α均阴性的胃癌组织比较有显著性差异(t=3.9470,P<0.05);pearson相关分析表明, pAKT与HIF-1α表达呈正相关(r=0.583. P<0.05)。详见表3，图6～8。

　　3　讨论

　　PI3K-AKT/PKB信号通路与人类肿瘤的发生发展密切相关，该通路调节肿瘤细胞的增殖和活化，其活性异常不仅导致细胞恶性转化，而且与肿瘤细胞的迁移、黏附、肿瘤血管生成以及细胞外基质的降解等相关。活化的AKT可磷酸化下游的酪氨酸和色氨酸残基，从而具有抑制细胞的调亡,促进细胞的增殖和生长及运动和侵袭，促进肿瘤血管生成等功能[4]。缺氧是实质性肿瘤微环境的基本特征之一,缺氧状态诱导一系列特异性的与血管新生、缺氧代谢密切相关的基因表达,帮助肿瘤细胞适应缺氧环境,在此过程中起关键作用的是HIF-1α。HIF-1α作为缺氧条件下细胞应答最基本的调控因子，与肿瘤的发生、预后及治疗反应存在着密切的相关性，PI3K-Akt/PKB信号通路可增强HIF-1α稳定性，使HIF-1α蛋白表达增加[5]。

　　本研究显示胃癌中pAKT、HIF-1α的阳性表达率显著高于癌旁组织。Itoh等[6]研究发现在结肠癌细胞中pAKT与细胞的黏附、运动、侵袭、转移密切相关。Iwao K等[7]在研究胃癌细胞时发现PI3K-AKT/PKB信号通路阻断剂LY294002可明显抑制肿瘤细胞的生长，加速细胞的凋亡，且HIF-1α的表达明显下降。在其他肿瘤如胰腺癌、甲状腺癌、大肠癌、卵巢癌和乳腺癌等也均发现AKT的过度活化，提示pAKT在肿瘤细胞恶性行为中起重要的作用[6、8、9]。我们研究发现，pAKT、HIF-1α蛋白与肿瘤的浸润深度、TNM分期及淋巴结转移及远处转移显著相关;癌旁组织中极少表达，且主要表达于癌旁肠上皮化生及不典型增生组织中，提示pAKT、HIF-1α蛋白可能与胃癌的早期发生有关。pAKT、HIF-1α蛋白表达存在显著的相关性，在胃癌的发生过程中AKT的活化可促使HIF-1α的活化及磷酸化，增加HIF-1α的稳定性，激活下游的靶因子，从而导致肿瘤的发生。

　　新生毛细血管的生成是实体肿瘤细胞生长、增殖的必要条件，也是肿瘤侵袭和转移的必要条件，肿瘤的缺氧状态可诱导与血管形成有关的多种细胞因子释放,促进肿瘤的生长和转移。研究表明HIF-1α是恶性肿瘤诱导新生血管形成的一个主要调控因子。乳腺癌和大肠癌细胞中AKT激活，可以通过HIF-1α促进肿瘤血管的生成[6，8]。本研究发现胃癌组织中的MVD显著高于癌旁组织，且pAKT、HIF-1α的表达与肿瘤血管密切相关， PKB、HIF-1α蛋白表达均阴性、二者之一阳性、二者均阳性三组肿瘤MVD依次升高，且胃癌中PKB、HIF-1α蛋白的表达存在明显正相关，提示在胃癌中pAKT可通过调节HIF-1α的表达从而参与胃癌血管的形成。

　　本研究表明，作为缺氧条件下重要的核转录因子HIF-1α与肿瘤浸润深度、TNM分期、淋巴结转移、远处转移等密切相关，尤其是缺氧条件下胃癌新生血管生成和恶性侵袭过程中起重要作用。pAKT作为PI3K/AKT信号转导途径中的关键蛋白，在细胞的凋亡、存活、增殖以及细胞骨架的变化等活动中发挥重要作用，通过PI3K/AKT通路调节HIF-1(的表达，进一步推进肿瘤的恶性进程、加速了肿瘤的不良转归，它们在胃癌血管生成和生长侵袭转移过程中具有相互叠加或协同作用。同时检测胃癌组织中pAKT、HIF-1α和MVD的表达状态，有助于全面了解胃癌发生、发展以及肿瘤血管生成的生物学信息，对于胃癌的早期诊断和治疗有重要的指导价值。

　　【参考文献】

　　[1] Lee BL, Lee HS, Jung J, et al. Nuclear factor-kappaB activation correlates with better prognosis and Akt activation in human gastric cancer[J]. Clin Cancer Res，2005,11(7):2518-2525.

　　[2] Kasuno K, Takabuchi S, Fukuda K, et al. Nitric oxide induces hypoxia-inducible factor 1 activation that is dependent on MAPK and phosphatidyl inositol 3-kinase signaling[J]. J Biol Chem, 2004,279(4):2550-2558.

　　[3] Vartanian RK, Weidner N. Endothelial cell proliferation in prostatic carcinoma and prostatic hyperplasia: correlation with Gleason's score, microvessel density, and epithelial cell proliferation[J]. Lab Invest, 1995,73(6):844-850.

　　[4] Ruiter GA, Zerp SF, Bartelink H, et al. Anti-cancer alkyllysophospho lipids inhibit the phosphatidylinositol 3- kinase-Akt/ PKB survival pathway[J]. Anticancer Drugs, 2003,14(2):167-173.

　　[5] Li YM, Zhou BP, Deng J, et al. A hypoxia-independent hypoxia-inducible factor-1 activation pathway induced by phosphatidylinositol-3 kinase/Akt in HER2 overexpressing cells[J]. Cancer Res, 2005,65(8):3257-3263.

　　[6] Itoh N, Semba S, Ito M, et al. Phosphorylation of Akt/PKB is required for suppression of cancer cell apoptosis and tumor progression in human colorectal carcinoma[J]. Cancer, 2000,94(12):3127-3134.

　　[7] Kobayashi I, Semba S, Matsuda Y, et al. Significance of Akt phosphorylation on tumor growth and vascular endothelial growth factor expression in human gastric carcinoma[J]. Pathobiology, 2006,73(1):8-17.

　　[8] Schmitz KJ, Grabellus F, Callies R, et al. Relationship and prognostic significance of phospho-(serine 166)-murine double minute 2 and Akt activation in node-negative breast cancer with regard to p53 expression[J]. Virchows Arch，2006,448(1):16-23.

　　[9] Nam SY, Lee HS, Jung GA, et al. Akt/PKB activation in gastric carcinomas correlates with clinicopathologic variables and prognosis[J]. APMIS, 2003,111(12):1105-1113.

　　[10] Mottet D, Dumont V, Deccache Y, et al. Regulation of hypoxia-inducible factor-1alpha protein level during hypoxic conditions by the phosphatidylinositol 3-kinase/Akt/glycogen synthase kinase 3beta pathway in HepG2 cells[J]. J Biol Chem, 2003,278(33):31277-31285.