p38及p27在大肠癌中的表达及其临床意义

　　作者：孙泽群 , 徐少勇, 邓长生,张 丽, 田 林 作者单位：郧阳医学院附属人民医院消化内科，湖北 十堰 442000

　　【摘要】 目 的:探讨人大肠癌中有丝分裂原激活蛋白激酶p38和细胞周期负性调控因子p27表达的临床意义。方法:应用SABC法检测46例人大肠癌组织及其正常大肠组织(距肿瘤>5 cm)中p38蛋白和p27蛋白的表达情况。结果:p38在大肠癌中的阳性表达率为95.65%，在正常大肠组织中阳性表达率为39.13%,定位于胞浆，胞核无表达,两者差异有显著性(P<0.01); p27在大肠癌中的阳性表达率为56.5% ,在正常大肠组织中阳性表达率为86.96%,主要定位于胞核,仅少量胞质表达, 两者差异有显著性(P<0.01)。p38和p27的表达都与患者年龄、性别、肿瘤大小、肿瘤部位没有相关性(P>0.05),与Dukes分级、肿瘤分化程度及淋巴结转移有密切相关，差异有显著性(P<0.01)。结论: 大肠癌组织中p38蛋白过表达及p27蛋白低表达都与大肠癌的发生、发展和转移密切相关，推测其可能作为反映恶性肿瘤生物学行为及预测预后的指标;p38可能是促进p27降解的一种负性调节因子。

　　【关键词】 大肠癌

　　Expression of p38 and p27 protein and its clinical significance in human colorectal carcinoma SUN Ze-qun1,2,XU Shao-yong1,DENG Changsheng2 , et al . (1Department of gastroenterology,Renmin Hospital，Yunyang Medical College,shiyan 442000; 2Department of gastroenterology,zhongnan hospital ,wuhan 430071)

　　Abstract:Objective To investigate the clinical significance of p38MAPK expression and cell-cycle-negative-regulator p27 expression in human colorectal carcinomas.Methods The samples were obtained from 46 cases . p38MAPK protein and p27 protein expression was detected by immunohistochemistry using the SABC staining method at the two sites: carcinoma tissue and its peripheral nomal tissue (5 cm away from tumor).Results Expression of p38MAPK protein was mainly localized in the cell cytoplasm and never in the nucleus and expression of p27 protein was mainly localized in the cell nucleus and only rarely in the cytoplasm . Positive rate of p38MAPK protein expression was 95.65% in carcinoma tissues,33.13% in its nomal tissue;Positive rate of p27 protein expression was 56.5% in carcinoma tissues,87.0% in its nomal tissue.p38MAPK and p27 protein expression in carcinoma tissue was correlated significantly with dukes stage (P<0.01),histology grade (P<0.01) and local lymph node involvement (P<0.01) ,but not with age ,gender,site or size of tumor (P>0.05).Conclusion p38 and p27 may play an important role in the occurrence，development and metastasis of human colorectal carcinoma;p27 was speculated to be likely one of the most important index to reflect the biological behavior of the malignant tumor and predict prognosis of colorectal carcinomas;p38 was likely a negative regulator of p27 by promoting its degradation .

　　Key words:Colorectal carcinoma;p38;p27;immunohistochemistry

　　细胞周期负性调控因子p27是近年发现的细胞周期蛋白依赖激酶抑制剂CKI家族中的重要一员。有丝分裂原激活蛋白激酶p38是其家族重要成员，炎症前因子和应激反应可使p38的酪氨酸和苏氨酸双磷酸化，激活p38[1]。p38活化后可使多种转录因子活化，调节细胞增殖。癌变是正常细胞分化异常、增殖过度与凋亡受阻的结果， MAPK信号传导通路异常对癌变起重要影响作用。p38 和p27与大肠癌的相关研究国内外报道少见。本课题旨在阐明p38、p27与大肠癌的发生、发展及预后的关系。

　　1材料与方法

　　1.1一般资料

　　连续收集郧阳医学院附属人民医院2003年9月-2004年10月手术切除的大肠癌标本46例(男26例，女20例，<50岁14例，≥50岁32例),均经病理检查确诊,并同时采集大肠肿瘤周围正常大肠组织(距肿瘤边缘大于5 cm)立即用4%多聚甲醛固定。所有病人术前未经放化疗处理。

　　1.2试剂

　　兔抗人p38 、p27多克隆抗体，浓缩型SABC免疫组化染色试剂盒均购自武汉博士德生物工程有限公司。

　　1.3实验方法

　　操作步骤严格按试剂盒说明进行。将石蜡包埋标本制成4 μm厚的切片，常规脱蜡至水化，经3%H2O2灭活内源性酶，分别与一抗(兔抗人p38、p27多克隆抗体，1∶100稀释)，二抗(生物素标记羊抗兔IgG)孵育，DAB显色，苏木素复染，封片观察。

　　1.4免疫组化结果的判定

　　免疫组化结果通过双盲法经2位有经验的病理专家独立评估。阳性p38染色位于胞质，阳性p27染色主要位于胞核，仅少量在胞质。每张切片随机选取10个高倍视野(×400)，分别计数100细胞。10个视野阳性细胞平均百分率被认为是阳性百分率。没有阳性细胞赋值为0，<30%赋值为1，31%~70%赋值为2，>70%赋值为3。染色程度标准据每张切片大多数细胞染色特征来决定。没有染色赋值为0，浅黄色赋值为1，棕黄色赋值为2，棕色赋值为3。最终结果由染色总数和染色强度共同决定。如果总值为0，为阴性，总值1~2之间，为弱阳性，总值3~4之间为中等阳性，总值5~6之间，为强阳性，总值2以下，为低表达，总值大于3，为高表达。

　　1.5统计处理

　　计数资料采用χ2检验进行统计分析。

　　2结果

　　2.1p38、p27在大肠癌及其正常大肠组织中的表达

　　p38表达定位于胞质中，呈棕黄色，胞核中无表达;p27表达主要定位胞核中，呈棕黄色，胞质中偶有少量表达。p38在大肠癌中的阳性表达率为95.65%，正常大肠组织中阳性表达率为33.13%，两者差异有显著性(P<0.01,表1);p27在大肠癌中的阳性表达率为56.5%，正常大肠组织中阳性表达率为87.0%，两者差异有显著性(P<0.01,表1)。表1 p38、p27在大肠癌及正常大肠组织中的表达 p38、p27表达与年龄、性别、肿瘤大小、肿瘤部位均无相关性(P>0.05,表2)，与Dukes分级、肿瘤分化程度及淋巴结转移密切相关，经统计处理，差异有显著性(P<0.01,表2)。 表2 p38、p27在大肠癌组织中的表达与临床病理特征的关系 p27高表达正常大肠组织中p38呈低表达，p27低表达大肠癌组织中p38呈高表达，组织分化程度越低，p27表达越低，p38表达越高,两者呈负相关。

　　3讨论

　　有丝分裂原激活的蛋白激酶(mitogen-activate protein kinases,MAPK)是一个非常重要的细胞内信号传导酶超家族，介导机体细胞的生长、分化、分裂、死亡等多种过程[2]。p38是MAPK家族重要成员，含有360个氨基酸，根据氨基酸序列推测p38的相对分子质量应为41 000[3]。p38活化后可使多种转录因子活化，调节细胞增殖,p38可激活MAPK-2及热休克蛋白HSP25/27等,介导细胞分化和凋亡[4]。Yan等[5]研究表明p38蛋白的过表达可能在乳腺癌的发生及转移中起重要作用。Zhang等[6]研究表明p38特异性抑制剂可抑制JAR细胞的侵袭能力。Mao等[7]研究表明VEGF通过p38MAPK信号传导通路诱导肝癌细胞转移，阻断p38MAPK信号传导通路，可抑制VEGF诱导的肝癌细胞转移。

　　我们应用免疫组化法检测了46例术前未行放化疗的大肠癌及其正常的大肠组织中p38蛋白表达情况，结果显示大肠癌组织中p38蛋白阳性表达率明显高于其正常大肠组织。提示p38蛋白的过表达可能在大肠癌的发生中起着重要作用,即可能促进癌细胞的增殖。我们的研究还说明，p38表达与大肠癌患者年龄、性别、肿瘤大小、部位无明显相关性,与Dukes 分级、肿瘤分化程度及淋巴结转移密切相关，因此，P38可能成为反映大肠癌生物学行为重要指标之一。淋巴结转移阳性患者P38蛋白表达水平高于淋巴结转移阴性患者，推测p38可能与大肠癌转移有关。

　　细胞的增殖与分化在胚胎发育及许多疾病的发生过程中起着至关重要的作用,细胞周期是细胞增殖与分化的最后通路,该处的调控直接影响细胞增殖与分化的结果。p27是polyak等于1994年发现的新的CKI基因，p27cDNA具有594 bp的开放阅读框架，编码198个氨基酸组成的蛋白质，具有多种生物学功能,可直接抑制cyclin-CDK复合物的生物学活性，阻止细胞通过G1-S期转换的“关卡”，同时作为细胞外刺激信号潜在媒介调控细胞周期。Loda[8]、Yao[9]、Fredersdorf[10]等通过检测不同分级或分期的大肠癌和乳腺癌组织中p27的表达，证实了在细胞核p27蛋白表达水平与肿瘤恶性程度呈负相关，认为p27kip1为一抑癌基因，可能是一种新的肿瘤标志物及肿瘤预后指标。

　　本研究表明，大肠癌组织中p27表达比正常大肠组织中表达明显降低，推测大肠癌组织中可能存在某种因子促进p27降解或者抑制p27活性，这个因子可能对于大肠癌发生非常重要。p27表达与大肠癌患者年龄、性别、肿瘤大小、部位无明显相关性,与Dukes 分级、肿瘤分化程度及淋巴结转移密切相关，研究结果和Spirin 等[11]报道相近。因此，p27被认为是反映大肠癌生物学行为的重要指标之一。p27的表达高低与大肠癌组织的分化程度相一致，这表明p27是诱导细胞分化的重要指标之一。因而推测p27可能成为判断大肠癌预后的一个指标。

　　本研究显示，p27高表达的正常大肠组织中p38呈低表达，p27低表达的大肠癌组织中p38呈高表达，肿瘤分化程度越低，p27表达越低，p38表达越高，说明p38和p27表达呈负相关, p38可能是p27的下调因子。Tomoda K 等报道[12]，在小鼠动物模型实验中，证实了p38蛋白由Jab1基因编码，和p27特异性相互作用,p38在哺乳动物细胞中过表达引起p27从细胞核到细胞质的转移，通过促进p27的降解降低在细胞中的总量。p38在小鼠成纤维细胞的异位表达,部分的克服了p27介导细胞周期G1期的停滞，明显降低它们对血清的依赖,表明p38是促进p27降解的一种负性调节因子。

　　总之，p38、p27与大肠癌的发生、发展和转移密切相关，推测其可能作为反映大肠癌生物学行为及预测大肠癌预后的指标;p38可能是促进p27降解的一种负性调节因子。

　　【参考文献】

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　　[2] Huang S,New L,Pan Z,et al.Urokinase plasminogen activator/urokinase-specific surface receptor expression and matrix invasion by breast cancer cells requires constitutive p38alpha mitogen-activated protein kinase activity[J].J Biol Chem,2000,275(16):12 266-12 272.

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　　[7] Mao H,Yuan AM,Zhao MF,et al.The effect of signal passway of mitogen activated protein kinase on hepatocellular carcinoma metastasis induced by VEGF[J].Chinese digestive journal,2002,20(1):14-16.

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　　[9] Yao J,Eu KW,Seow-Choen F,et al.Down-regulation of p27 is a significant predictor of poor overall survival and may facilitate metastasis in colorectal carcinomas[J].Int J Carcer,2000,89(3):213-216.

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　　[12] Tomoda K,Kubota Y,Kato J.Degradation of the cyclin-dependent-kinase inhibitor p27Kip1 is instigated by Jab1[J].Nature,1999,398(6 723):160-165.