小鼠急性脂肪栓塞综合征模型中炎症因子及炎症信号通路的激活

脂肪栓塞综合征(FES)是创伤、骨折及内固定手术后的严重并发症。患者循环中存在大量未乳化脂肪而造成的临床危FES的具体发病机制尚未完全清楚,有机械性损伤和生化性损伤两种学说。机械性损伤学说认为损伤后的骨髓或软组织局部的游离脂肪滴进人血循环,机械栓塞了小血管和毛细血管,形成脂防栓塞;生化性损伤学说认为创伤后机体产生应激反应释放大量儿茶酚胺,使肺及脂肪组织内的脂肪酶活动增加,在脂肪酶作用下,水解产生甘油和游离脂肪酸,而游离脂肪酸可引起肺损伤[1]。日前普遍认为,FEs的病理损伤是机械损伤和生化损伤共同作用的结果,但与对机械损伤相对明确的认识不同,生化损伤在FES中的严重程度、作用时问和对预后的影响均尚有争议,其具体作用机制也不明确。本实验选择经静脉注射半数致死剂量(lethal dose50,LD50)的同种异体小鼠肾周脂肪,观察FES病理过程中炎症因子的变化和相关炎症信号通路蛋白的表达,探讨炎症反应在FES中的作用及机制。

1材料与方法

1.1 实验动物

健康雄性C57BL/6小鼠,平均体质量为(24±2)g,由上海西普尔-必凯实验动物有限公司提供,上海交通大学附属第六人民医院动物中心饲养。动物生产许可证号为SCXK(沪)2OO8-0016,使用许可证号为SYXK(沪)2011-0128。动物饲养和实验均处于SPF级环境,小鼠笼盒饲养,白由进食、饮水。

1.2 主要试剂和仪器

兔抗小鼠NF-κB(p65)单克隆抗体;髓过氧化物酶(MPO)检测试剂盒(南京建成生物工程研究所);TRIzol试剂;Real-Time PCR反转录试剂盒和SYBR⒍een试剂盒,引物由TaKaRa公司设计合成;ELISA试剂盒(R&D,美国);超细匀浆机(Fltllco,德国);超声细胞破碎仪;4℃低温离心机(Eppendorf,德国);实时荧光定量PCR仪(Roche,瑞士)。

1.3 脂肪制备和保存

采自同种异体小鼠的肾周脂肪,无菌条件下收集后使用超细匀浆机分散乳化,初步乳化后再使用超声细胞破碎仪充分破膜,液化的油脂混合物置于4℃低温离丿b机中40O0×g离心钔min,取上层透明均一的橙黄色油脂,—⒛℃保存各用。使用前放置于37℃恒温水浴箱内,融解充分、漩涡仪匀质后使用。

1.4小鼠脂肪栓塞模型的建立和验证

1.4.1 建立脂肪栓塞模型取108只小鼠随机分成9组,每组12只,标记为1~9号组,分别给予1~9uyg小鼠肾周脂肪,使用乃0uL微量进样器从小鼠尾静脉缓慢推注,记录注射后0、0,5、2、4、6、8和⒛h的死亡情况和死亡数量,B1iss法统计小鼠脂肪栓塞LD50。

1.4.2 肺组织形态学观察取6只小鼠随机分成实验组和对照组,每组3只。实验组小鼠尾静脉注射4uL/g脂肪,对照组注射相同剂量的生理盐水,4%多聚甲醛灌注肺循环和肺泡腔后取肺组织,4%多聚甲醛中固定2d,石蜡包埋,切片进行苏木精-伊红(HE)和油红(Ho)染色处理。

1.4.3 动脉血气分析取18只小鼠随机分成6组,每组3只。小鼠注射4uL/g脂肪后,分别于0,5、2、4、6、8和舛h经腹主动脉取血,检测动脉血氧分压(PaO2)和二氧化碳分压(Paco2),并与正常对照组(未作任何处理,n=3)的血气值进行比较。

1.4.4 肺组织干湿质量比值(D/W)测定 取15只小鼠随机分成5组,每组3只,分别为对照组、2、4、6和8h组。对照组尾静脉注射4uL/g生理盐水,其余各组均注射4uL/g脂肪,于上述各时间点取肺组织测定D/W。

1.5脂肪栓塞模型中的炎症反应

取30只小鼠随机分成2组,每组15只。①实验组:尾静脉注射LD50(4uyg)脂肪;②对照组:注射相同剂量的生理盐水c在注射脂肪后的0,5、2、4、6、8h5个时间点采集组织。无菌条件下实施手术,术前5min戊巴比妥钠(70mg/kg)麻醉小鼠。腹腔切口,暴露膈肌,在膈肌上剪口暴露心肺。沿胸骨柄向上剪开至颈部,暴露气管。固定心脏,左`心房剪口,灌注针从右心室进针,缓慢推注⒛mL生理盐水,排空肺循环血液至肺叶呈白色,灌注液澄清。颈部剪口,暴漏气管并剪口,从气管进针灌注肺泡腔,灌注3次,每次进液约1.5mL。排空灌注液后取肺组织。观察指标:实验组注射4uVg脂肪30min后,下腔静脉采血,3O00×g离心30min取上层血浆,酶联免疫吸附法(ELISA)检测血浆炎症因子IL-lβ和TNF-α;Real-Time PCR检测IKKβmRNA的表达水平;Western blotting检测NF-KB(p65mbulllt)蛋白的相对表达量;化学比色法检测MPO活性。

1.6 统计学方法

采用SPSS130软件进行数据处理。多组比较采用单因素方差分析和SNK检验;两组比较采用独立样本J检验。P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Bliss法计算LD50

Bliss法分析108只小鼠死亡率,统计得出小鼠脂肪栓塞模型LD50=(3.9266±0.7810)uL/g,为便于实验采用4uL/g(表1)。通过观察小鼠脂肪栓塞的死亡情况,发现小鼠脂肪栓塞模型中,超过95%的死亡发生在⒛min内(超急性期),其余死亡均发生在8h内(急性期),8h后的死亡率为0,可以长期存活。

2.2 脂肪栓塞模型建立的验证

2.2.1 肺组织形态学观察 与对照组相比,实验组小鼠的大体肺组织可见栓塞病灶;镜下可见明显充血水肿,肺泡壁断裂以及炎症细胞浸润;HO染色发现血管腔和肺泡腔中存在脂滴(图1)。

2.2.2 动脉血气分析 与正常对照组相比,实验组小鼠注射脂肪后早期h02显著下降(图2A),PaC02显著上升,并随时间推移而逐渐恢复,24h时基本接近正常(图2B)。

2.2.3 肺组织D/W测定结果与对照组相比,注射脂肪后急性期(2h)肺组织D/W显著上升,反应肺组织充血水肿,之后维持较高水平,8~10h后开始回复(图3)。

2.3 LD50脂肪栓塞模型中的炎症反应

2.3.1 血浆IL-1β和TNF-αELISA法检测结果J壶示:与对照组比较,实验组血浆炎症因子IL-1β和TNF-α均显著高于对照组,差异有统计学意义(P<0.01)(图4)。

2.3.2 MPO活性与对照组比较,实验组小鼠的肺组织匀浆液MPo活性在注射脂肪后的早期(30min)即已显著升高,差异有统计学意义(P<0.O5)(图5)。

2.3.3 肺组织核转录因子

Rea1time PCR检测结果显示:与对照组相比,实验组在2、4h时点IIqKβmRNA的相对表达量明显升高,差异有统计学意义(P(0.0~s)(图6)。Western blotting测定肺组织匀浆液中核转录因子NF-κB(p65subunit)的相对表达量,与对照组相比,实验组在0.5、2、4h时点的相对表达明显升高,差异也有统计学意义(P<0.O5)(图7)。

3 讨论

目前,对FES的病理机制的研究认为,脂肪入血后阻塞肺微血管,首先引起机械损伤,血管内压力增高,血流阻力增大导致流速降低,肺血管内红细胞、乳糜微粒和血小板淤积,而栓塞的脂肪微粒又为它们提供了附着的表面,导致栓塞进一步加重。这些变化导致肺泡血流灌注不足,从而引起通气血流比例失常及低氧血症。在经过机械损伤的代偿期之后,肺泡微血管内皮细胞分泌的脂肪酶把血中的二酰甘油和脂肪分解为甘油和游离脂肪酸,生化性损伤达到高峰[2-3]。本研究中,超过95%的脂肪栓塞小鼠均在30m血内死亡,证明脂肪栓塞早期是死亡最集中发生的时期,临床观察同样显示这一结果[4]。

在脂肪栓塞小鼠肺组织病理切片上观察到,发生脂肪栓塞时仅有部分肺叶或肺段有明显栓塞梗死灶,但是在整体,早期Pao2极度降低、肺渗出水肿,说明脂肪栓塞早期发生了涉及全肺的炎症反应,导致以肺功能降低为表现的严重生化损伤。目前研究[5]认为,脂肪在体内分解而成的脂肪酸引发了炎症因子的释放,以及免疫反应的激活。但FES全身性炎症反应对机体的损伤机制目前仍不清楚,早期生化损伤的严重程度也没有定论。本研究中,急性期(2h)动脉血气Pao2极度降低并随时间而缓解,反映了LD50模型中在FES急性期对机体打击最严重。既往研究[6]多认为,在FES急性期机械阻塞占主导作用,导致肺血管阻塞,肺血流障碍引发肺水肿,导致肺功能下降。而脂肪栓子诱发局部细胞释放炎症因子,活化机体免疫反应,在机械损伤代偿期起重要作用。本研究中,发现肺D/W在脂肪栓塞2h后的急性期内尚未发生显著性变化,4h后方有显著改变,6h最为明显,8h开始缓解,反应了在脂肪栓塞后肺组织水肿是一个缓慢且逐渐加重的过程,其严重程度与预后(死亡)无直接相关。进而我们假设,在脂肪栓塞后的急性期内,生化损伤可能起了比预期更为重要的作用。本研究中,在脂肪栓塞后的超急性期(30min),血浆中炎症因子IL-1β和TNF-α的水平已显著上升.MPO活性可以间接反映肺组织中炎症细胞的激活和炎症因子的释放情况,结果发现,在注射脂肪30min内MP0活性同样显著升高。上述结果显示,在脂肪栓塞的早期,机体的炎症反应已经存在,与机械损伤一起引起严重的组织损伤和呼吸功能障碍。推测可能是由于进人肺循环的脂滴只有少部分真正阻塞了肺微血管,引起通气血流学变化,但大部分脂滴仍以游离形式通过肺循环,在循环各处引发全身性的炎症反应。因此,脂肪栓塞急性期死亡是肺部脂肪栓塞的机械性损伤和炎性反应共同作用的结果。

NF-κB参与体内多条信号转导途径,在炎症及肿瘤等病理过程的发生发展中发挥重要作用[7]。血浆炎症因子IL-1β和TNF-α可通过多种途径激活NF-κB介导的炎症信号通路,而NF-κB通路激活后进而促进释放IL-1β等炎症因子[8,9]。我们已观察到脂肪栓塞后,IL-1β和TNFα大量释放人血。囚此,我们推测血浆炎症因子可能进一步激活NF-κB参与的信号转导通路,激活的NF-κB又引发炎症对机体的二次打击,加重脂肪栓塞对机体的损伤。本研究中,检测κB抑制蛋白激酶1KKβ(NF-κB活化关键因素)的基因表达,和NF-κB复合体的Ⅱ5亚单位蛋白表达情况,发现在脂肪栓塞中确实存在NF-κB的活化,提示在FES中NF-κB介导的炎症信号通路确实参与了脂肪栓塞造成的肺组织生化损伤。

本研究建立了稳定的脂肪栓塞动物模型,选取LD5。作为衡量脂肪栓塞程度的可靠指标,发现在FES急性期,炎症反应对机体的损伤可能起了比目前所知更为重要的作用。在脂肪栓塞的动物模型中,血浆炎症因子水平在栓塞后早期即显著升高;NF-κB p65蛋白和IKKβ基因表达增多,证明NF-KB介导的炎症信号通路参与了FES的炎症反应,为全面认识FES的发病机制,进一步探索临床降低FES急性期死亡率提供了新思路。

4 参考文献

[1]Akhtar S. Fat embolism[J].Anesthesiol Clin,2009,(03):533-550.

[2]Wang AZ,Ma QX,Zhao H J. A comparative study of the mortality rate of rats receiving a half lethal dose of fat intravenously:under general anaesthesia versus under spinal anaesthesia[J].Injury.British Journal of Accident Surgery,2012,(03):311-314.

[3]Chen HI. From neurogenic pulmonary edema to fat embolism syndrome:a brief review of experimental and clinical investigations of acute lung injury and acute respiratory distress syndrome[J].Chinese Journal of Physiology,2009,(5 Suppl):339-344.

[4]Riska EB,Myllynen P. Fat embolism in patients with multiple injuries[J].Journal of Trauma-Injury Infection and Critical Care,1982,(11):891-894.

[5]Sen RK,Tripathy SK,Krishnan V. Role of corticosteroid as a prophylactic measure in fat embolism syndrome:a literature review[J].Musculoskelet Surg,2012,(01):1-8.

[6]Hauser CJ,Sursal T,Rodriguez EK. Mitochondrial damage associated molecular patterns from femoral reamings activate neutrophils through formyl peptide receptors and P44/42 MAP kinase[J].Journal of Orthopaedic Trauma,2010,(09):534-538.

[7]Greten FR,Eckmann L,Greten TF. IKKβ links inflammation and tumorigenesis in a mouse model of colitis-associated cancer[J].Cell,2004,(03):285-296.

[8]Cao Z,Xiong J,Takeuchi M. TRAF6 is a signal transducer forinterleukin-1[J].Nature,1996,(6599):443-446.

[9]Ninomiya-Tsuji J,Kishimoto K,Hiyama A. The kinase TAK1 can activate the NIK-IκB as well as the MAP kinase cascade in the IL-1 signalling Pathway[J].Nature,1999,(6724):252-256.