骨髓间充质干细胞移植治疗脑外伤的研究进展

近年来,干细胞疗法已成为治疗多种疾病的新策略,其目的是替代、修复受损组织或器官的生物学功能[l]。随着研究的深人,骨髓间充质干细胞(BMSC)在脑外伤、脑血管病、中枢神经系统变性疾病等方面将有更广泛的应用。

外伤性颅脑损伤(TBI)是神经外科常见的疾病,其致残率及致死率占全身各器官损伤之首。最新的数据显示,TBI每年在美国直接影响150万人的健康,重症损伤者导致永久的不可逆的身体运动、认知、精神的缺陷[2]。目前在中国,颅脑外伤也呈逐年上升的趋势。

BMSC起源于中胚层,可跨胚层分化多种细胞,包括成骨细胞、神经细胞、心肌细胞等。移植改善神经功能的机制目前尚未明确。

总起来说,MSCs来源充足,容易获取,在局部麻醉下即可获得,可通过体外培养大量扩增,可动、静脉注射,从而避免侵入性的操作即可到达损伤脑的局部;禾刂用自身的MsCs进行移植还可避免移植物抗宿主反应,可以分泌大量的生长因子和促血管生长因子。BMSC还具有易于分离、扩增迅速和多分化潜能等特点使其成为脑外伤治疗良好的细胞来源。因此作为“源种子”细胞优于传统的胚胎干细胞,且BMSC的应用不存在伦理学问题的争论,其应用有独特的优势。

以往有很多关于BMSC植治疗脑损伤的相关报道,本文就BMSC移植在脑外伤治疗中的作用和功能,和在损伤的脑组织中存活、迁移、分化或与功能恢复相关的特征,脑宿主对移植的反应以及干细胞对试验性损伤的反应及相应的分子机制进行综述。

1 BMSC的生物学特性和鉴定 BMSC是骨髓造血结构性和功能性支持细胞,具有多向分化和自我更新能力,可分化为间质细胞谱系和非间质细胞谱系如神经细胞分化的潜能,移植后可分化为神经元及神经胶质细胞,可充当损伤后修复的细胞来源,对中枢神经系统损伤疾病的治疗具有潜在的广泛应用前景[3]。和其他干细胞相比,BMSC可通过动静脉移植降低由于脑内移植引起的并发症;可自体移植,避免免疫排斥反应;细胞来源充足,不存在伦理学的争论[4],有良好的应用前景。骨髓间充质干细胞为非造血系干细胞,表达阳性的细胞表面标志物常用的有CD13、CD29、CD44、CD54、CD90、CD97、CD112、CD105、CD106、CD166、sCA-1抗原、sTRO1抗原、Gkit抗原等。Zhao等[5]用CD29、CD44、CD90阳性表达签定BMSC成功。Halfon等[6]用CD29、CD44、CD90、CD166等阳性表达签定BMSC。Niehage等[7]用CD97、CD112等阳性表达签定BMSC。

2 BMSC的移植途径

脑实质内移植:脑实质内移植是采用立体定向注射方法,将BMSC直接注射人损伤部位或其他正常脑实质内,因此按移植部位可分为损伤中心、损伤边缘及对侧脑实质移植等。脑实质内移植克服了血脑屏障、脑脊液脑屏障等因素影响,细胞直接进人脑实质内,并易于聚集在病灶及其周围发挥治疗作用,疗效迅速、直接。但是,注射可造成新的脑损伤,不利于疗效评价,且移植的细胞数量有限,还可导致局部干细胞过度聚集,不利于其向其他细胞的分化[8]。全身移植:全身移植分为静脉注射移植和动脉注射移植,随着血液循环进人脑实质。全身移植的优点是移植的细胞数多,并发症少;缺点是受到血脑屏障(BBB)的影响大,还受血液内成分及体内代谢等因素的影响。也有很多文献报道经静脉移植干细胞治疗大鼠脑外伤,但细胞随血液循环后,经过肺微血管系统屏障[9],肝脾首过效应[10]极大地降低细胞的存活率到达脑损伤区域,难以促进神经功能和认知功能恢复。动脉移植易引起动脉狭窄,还会增加引起血管栓塞的概率。

3 BMSC移植入脑内的存活、分化和迁移

Yoon等[10]用(111)1n-tropolone标记的间充质细胞(MSCS)静脉注射人急性颅脑损伤模型,分布于大脑的标记BMSC被摄取,脑摄取的BMSC(111)中检测到创伤模型组(1.4%)显着高于假手术组(0.5%)或健康大鼠(0.3%)。放射性标记骨髓基质干细胞共聚焦显微镜观察显示,尽管他们的增殖能力受到抑制,他们仍有寻靶能力。Bakhtiary等[11]用静脉注射BMSC治疗TBI大鼠后于42d处死,免疫组化发现Brdu标记的BMSC分布在大脑,并且一定程度改善神经功能。说明BMSC在体内能够存活、迁移、分化为神经细胞。Cheng等[12]用超顺磁性氧化铁标记的BMSC后移植TBI大鼠大脑后的第1、3周,用MRI监测和普鲁士蓝染色发现,BMSC向大脑周围存活、迁移。Lundberg等[13]经血管移植BMSC到TBI大鼠的第1天和第5天发现更多的BMSC在受损伤的大脑半球存活、迁移,提示脑外伤或坏死可作为诱导环境,或者一旦发生后可产生一些信息物质(很可能为炎性物质),刺激MsCS增殖,然后透过破坏的BBB迁移至脑损伤区域,以修复脑损伤后的神经功能缺损。Borlongan等[14]研究指出,BMSC在移植人脑缺血和脑卒中的动物模型后能有效地迁移并对其神经功能受损的治疗发挥积极的作用。

4 BMSC保护神经细胞的分子机制

BMSC可分泌细胞因子和神经营养因子(NTFs),促进宿主神经营养因子的表达从而保护神经细胞。BMSC可分泌多种细胞因子,其中部分因子在神经细胞发育及分化过程中发挥重要作用。BMSC在损伤局部反应性分泌多种神经营养因子:脑源性神经营养因子(BDNF)、神经生长因子(NGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、血管内皮生长囚子受体(VEGFR)、碱性成纤维生长因子(bFGF)等。这些因子能产生神经保护作用和促进局部血管增生,神经再生等,从而起到了治疗神经损伤的作用。Chen等[l5]发现,用体外研究中酶联免疫吸附试验测定(ELISA)证实了在DMEM培养的MSCS大量生产NGF神经营养因子至少7周,在大鼠TBI后脑室内注射MSCS后,在脑积液通过ELISA NGF明显增加,证实这种结果。Zhang等[16]在体外试验发现,BMSC表达bFGF和BDNF。Kim等[17]在大鼠TBI后24h,注射间充质干细胞,2d后的HMSC组从大脑两半球提取组织定量酶联免疫吸附试验显示神经营养因子(NGF、BDNF、NT-3)表达明显增高,AKT表达明显上调。此外,学者发现移植到中枢神经系统的BMSC存活、分化为神经元,神经祖细胞,表达B3T、GFAP、MAP2、NF⒛0、NcuN和分泌BDNF[16-18]。以上神经营养因子和信号通路分子的变化和激活可能与促进脑外伤后神经细胞功能恢复有关。Horita等[19]将人骨髓源性间充质干细胞(hMSCs)经静脉注射移植人大脑中动脉闭塞的脑功能缺陷大鼠模型后发现,移植对大脑功能缺陷有显著的改善作用;他们进一步发现,经GDNF基因修饰的GDNF-hMSCs移植对永久性大鼠大脑中动脉闭塞模型的功能恢复发挥了重要作用。以上提示BMSC移植对脑外伤后神经功能恢复作用可能与其移植后在宿主体内分泌神经生长因子有关。

5 BMSC参与免疫调节

BMSC可参与免疫调节,抗凋亡功能。Galindo等[14]发现BMSC治疗显示出可以调节免疫功能。Xue等[21]用MSCs移植治疗TBI大鼠,减少大脑炎症反应和受损面积。据推测,TBI可启动免疫应答和释放炎症因子,通过神经胶质细胞创造一个对神经滋生不利的微环境。在体外MSCs分泌的因子,及分析细胞因子在TBI模型体外的表达,显示了BMSC在体外分泌因子增加NSC的细胞增殖和诱导神经胶质原纤维酸性蛋白的高表达,提示了分化为星形胶质细胞的趋向。在体内实验显示MsC注人急性TBI模型,缩小这些细胞因子的范围,提示BMSC分泌因子可以在损伤部位调节炎症反应,对于内源性干细胞可以作为一个有利的微环境和修复损伤组织。此外,BMSC能够激活神经营养信号分子,学者证实[22],用大鼠神经细胞体外免疫印迹分析证实,显示BMSC提高Erk1/2 and Akt在神经元的磷酸化作用和MEK1抑制剂PD98059和PI3-K抑制剂Ly294002可阻断BMSC的神经保护性作用。

6 脑外伤后内源性调节机制

脑损伤是中枢神经系统的-种严重创伤,如何促进脑损伤后的神经再生和功能恢复尤为棘手。传统认为中枢神经系统损伤后不能再生,主要原因有以下4个方面:(1)中枢神经系统的神经元是一群高度分化的细胞,损伤后本身缺乏再生能力;(2)NTFs及支持因子分泌不足,受损神经元得不到营养,而逐渐凋亡、坏死;(3)损伤后微环境中含有一些抑制轴突再生的分子,如Nobco蛋白、髓鞘相关糖蛋白MAG等[23]。脑外伤后一些细胞因子的表达发生变化,加强神经细胞的可塑性。脑损伤导致了损伤局部的细胞的快速凋亡和功能回路的破坏。损伤后细胞凋亡,组织恢复再生过程被激活,通过新的神经元和存活神经元的神经胶质,轴突萌芽,新的突触形成帮助重建新的结构形成,数月后达到一定水平上的功能恢复。但脑损伤后的再生过程是极为有限的[24]。脑损伤后,通过激活生存、修复基因如NGF1、BDNF[25]来增强其可塑性。中枢神经系统损伤后,BDNF通过激活PI3K/Akt/mTOR/s6、P38MAPK、p44/p42MAPK等信号通促进突触的再生[26]。Shioda等[27]制作中枢神经损伤模型后,将PI3K/Akt和ERK信号的激动剂进行腹膜内注射,结果发现PI3K/Akt和ERK信号激活能加强脑损伤后神经再生,促进sVZ和SGZ再生神经元的迁移。损伤后的几天,运动功能有一定程度的恢复,提示了神经功能的恢复,可能是因为轴突的暴露和激活[28]。但以上的内源性修复作用微弱,不足以弥补缺损的神经功能,故很多学者致力于干细胞移植治疗方面的研究,并取得了显著的成效。BMSC移植治疗脑外伤及其取得的显著效果与脑外伤后的内源机制及相关促进机制仍需进一步深人研究。

7 BMSC与TBI研究进展

随着对TBI研究的不断深人,人们对其发病机制的认识不断加深,各种新的治疗方法陆续应用于临床,TBI患者的救治效果明显提高,致残致死率显著降低。BMSC代表了一种非常有前途的细胞治疗手段,移植到体内后,促进内源性神经生长,减少细胞凋亡和自由基的水平,促进受损神经元突触连接和调节炎症反应。在美国干细胞注人中枢神经系统治疗TBI或中风的临床试验正在进行中[29]。Schira等[20]用外源性BMSC移植进人体内,发现BMSC聚集在中枢神经系统损伤区,减少损伤区面积,增加神经元轴突再生和改善行为学功能。Chen等[15]用体外和TBI大鼠体内研究证实了BMSC分泌多种神经营养因子并促进TBI大鼠神经行为学功能恢复。bFGF能提高在SVZ和海马区的细胞增殖,改善大鼠TB1后的认知功能,Bhang等[31]用含有碱性纤维生长因子的间充质细胞,移植到大鼠脑外伤部位上,明显减少细胞凋亡和梗死面积,改善神经功能评分,提高组织和功能的恢复。Zanier等[32]用MSC移植到脑外伤小鼠后,水迷宫和神经行为学测试显示明显改善神经功能和记忆学习能力。Wang等[31]通过转染末端转移酶端粒和腺病毒脑源性营养因子的MSCs来治疗TBI后受损的神经元,转染的MSCs的抗损伤效果通过Westeln blotung检测神经凋亡基因微管缔合蛋白2(MAP2)和细胞核因子(NFkappaB)和受损神经元释放的乳酸脱氢酶,证实了移植转染的BMSC可以提高受损神经元的BNDF的表达和减轻受损神经元的凋亡。

BMSC向神经细胞方向分化的潜力及移植后对实验动物外伤性脑损伤的功能改善作用已逐渐得到人们的认可,它为人类的神经系统疾病尤其是脑外伤疾病的治疗提供了一条新的途径。从这些研究结果看来,BMSC移植治疗脑外伤的机制有可能是多种因素作用的结果,与MSCs分泌一些细胞因子、神经营养因子有关,随后MSCs激活病灶区细胞的自我修复,甚至取代已死亡的神经细胞。在过去干细胞研究中对MSCs生物学特性已有了相当的认识,这对其运用于临床治疗提供了坚实基础。随着对其特性的不断揭示,将来能够研究清楚BMSC治疗作用机制并指导临床应用,将会给脑外伤的治疗带来一场革命性的进步,具有广阔的临床应用前景。其他如体内、外诱导BMSC定向分化的因素及其分子作用机制,移植细胞的安全性、有效性问题等,目前尚未解决。另外,现有的研究结果主要是通过动物实验得来的,而动物TBI的病理机制及损伤后的修复机制与人类不尽相同。因此,将BMSC真正用于临床治疗人类TBI,是一个漫长而又充满希望的过程。

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