红景天对高原环境中大鼠神经功能损伤的保护作用

青藏高原被誉为世界屋脊,一向以其独特的人文和自然景观闻名于世,是生态旅游胜地。然而高原的特点是空气稀薄,大气压低、氧分压低。脑组织对缺氧的耐受性低,急性缺氧时,可发生急性高原反应,缺氧持续或加重时,可诱发脑损伤和其他器官病变。研究发现在高海拔地区对认知功能和神经功能损伤的影响取决于海拔高度和停留时间[1]。红景天作为一种环境适应原性药物,已有很多资料表明它在抗缺氧抗寒冷、抗疲劳等方面均有良好的功效[2]。然而,大量的实验研究使用低压氧舱作为实验平台,较少有真实环境中的实验报告,本研究选取青藏高原不同海拔高度地区(西宁2200m、兴海3500m、玛多4200m)为实验动物饲养场所,观察高原低压缺氧对中枢神经系统的损伤变化,并使用红景天预处理,观察大鼠神经功能变化及红景天对神经功能损伤的保护作用。

1 实验资料

1.1 材料

1.1.1 动物 SD雄性大鼠60只,体质量180~200g,由青海省地方病研究所实验动物中心提供,清洁级。

1.1.2 药物 红景天胶囊购自青海省三普药业公司,HochsB3258染料购自碧云天生物技术研究所。其余试剂为国产分析纯级.

1.2 方法

1.2.1 高原模型建立 动物随机分组,分为西宁组、西宁预处理组、兴海组、兴海预处理组、玛多组、玛多预处理组。建模方法为经红景天预处理后各组分别在西宁青海大学医学院、兴海县人民医院、玛多县人民医院设独立饲养室饲养。

1.2.2 红景天预处理 SD大鼠每天给予红景天灌胃,红景天100g(含红景天苷0.4只),水煎3次,收集煎出液,浓缩至50mL,即1mL对应红景天2g,按每100g体质量0.5mL灌胃,持续2周。

1.2.3 大鼠神经功能学观察和评分 到达高原后6~12h,从动物触觉、痛觉和运动能力变化评价高原环境对大鼠神经功能的影响。

1.2.4 组织取材和常规切片染色 动物饲养30d后,脑组织取材,固定,石蜡包埋,冠状切片,常规甲苯胺蓝染色,脱蜡、水化,用0.5%甲苯胺蓝溶液染色30min,80%乙醇分色,镜下控制,以尼氏小体显示清晰为度。乙醇脱水、透明,中性树脂胶封片。观察细胞形态变化。

1.2.5 Hoechst33258染色 组织切片常规脱蜡,水化,每个组织上加40uL Heochst33258染液,避光37℃孵育7min,PBS洗2次,50%甘油封片;荧光显微镜观察,照相,分析细胞变性和凋亡比例。

1.3 观察项目 荧光染色结果用荧光显微镜高倍镜观察,随机选择6个视野,计数近似荧光强度细胞数,计算凋亡细胞所占比例。

1.4 统计学处理 所有数据均应用SPSS13.0统计软件进行分析,统计结果以均数±标准差表示,采用one way ANOVA LSD方差分析,组间比较用t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠到达高原,安静环境饲养6h,通过刺激观察触觉、痛觉和运动能力变化玛多组出现明显的自主活动增多或减少,避暗运动迟缓,触觉反射异常和痛觉回缩能力减弱。而红景天预处理可有效改善动物感觉和运动功能。见表1。

2.2 甲苯胺兰染色镜下变化 西宁组各脑区的神经元清晰可见,细胞结构完整,胞核淡染,神经突起完整,少见变性细胞。兴海组光镜下可见部分脑区神经元周围间隙增大,细胞肿胀,可见变性细胞,表现为神经元皱缩变形,呈三角形改变,核暗染,固缩,呈空泡状。玛多组在皮质,海马和纹状体可见较多变性细胞。红景天预处理各组与相应对照组比较变性神经元数量较少,细胞排列规整。见图1~6。

2.3 细胞凋亡情况 Hoechst33258荧光染料能少量地进人正常细胞膜,可使其染上低蓝色,凋亡细胞中的Hoechst比正常细胞的要多,荧光强度要比正常细胞中的高。兴海组和玛多组在海马CA1、CA3,齿状回(DG),纹状体和皮质均可见凋亡细胞。红景天预处理各组凋亡细胞比例下降,见表2。

3 讨论

初人海拔3000m以上地区,大多数人都可出现高原反应症状,迅速登山更易发病,进人高原数小时后出现症状,主要是头痛、头晕、胸闷、气短、心悸、食欲减退,恶心、呕吐常见,记忆力和思维能力减退,可伴有失眠、多梦,部分人有口唇发绀,少数人血压暂时升高,一般1~2d症状明显,以后减轻,1周左右消失,但也有少数人症状急剧加重,发展为高原肺水肿或高原脑水肿。研究发现脑组织对缺氧耐受低,特别是皮质和海马对缺氧的耐受性更低,长时间剧烈缺氧可导致神经元变性,增加细胞凋亡比例[3-4]。本实验结果显示,初到高原,在海拔42OO m玛多地区大鼠有明显高原反应现象,表现为呼吸频率增加,心跳加快,数小时后观察大鼠感觉功能迟缓,自主活动异常,避暗运动能力降低,同时动物食欲也表现为下降。低压缺氧对神经功能的损伤和神经元活性下降、细胞变性密切相关,实验发现在海拔3sOO m的兴海地区大鼠皮质和海马出现神经元周围间隙增大,细胞肿胀和神经元皱缩变形,而在海拔4zO0m的玛多地区大鼠皮质和海马神经元有明显的皱缩变形,细胞呈三角形改变,有些细胞出现核暗染、固缩和空泡状改变,结果提示长时间低压缺氧可促使皮质和海马神经元变性。

红景天属景天科,一般生长在海拔8O0~25O0m高寒无污染地带,在两千多年前就是藏药的一种,能够增强体质,提高身体对缺氧刺激的适应力。研究发现,红景天属植物的主要有效成分红景天苷可抑制脑组织缺血及再灌注过程中自由基和NO产生,红景天苷通过加强自由基的清除、调节凋亡和抗凋亡蛋白的表达来减轻脑缺血再灌注损伤[5-6]。细胞凋亡是在某些生理或病理因素诱导下,遵循自身的程序,启动一系列死亡基因的表达,引起内源性核酸内切酶和蛋白裂解酶的合成,导致DNA裂解乃至细胞的主动死亡。而通过药物的干预可以改善神经元细胞凋亡的情况。本实验结果显示,在较低海拔地区大鼠海马、纹状体和皮质有少量凋亡细胞,随着海拔高度增加,凋亡细胞比例也增加,在海拔4200m的玛多地区,皮质和海马凋亡细胞比例明显高于西宁地区。红景天预处理后,各组凋亡细胞数明显低于同地区对照组,提示红景天可以通过降低神经元凋亡保护因低压缺氧所致的神经功能损伤。红景天抗缺氧,抗凋亡的机制非常复杂,笔者将在今后的研究中逐步探讨,为红景天临床应用提供理论依据。

[参考文献]

[1]Lieberman P,Morey A,Hochstadt J.Mount Everest:aspace analogue for speech monitoring of cognitive deficits and stress[J].Aviation Space and Environmental Medicine,2005,(06):198-207.

[2]肖妤,李绍平,王一涛.红景天的药理研究进展[J].实用医院临床杂志,2006,(03):98-99.

[3]Maiti P,Singh SB,Mallick B.High altitude memory impairment is due to neuronal apoptosis in hippocampus,cortex and striatum[J].J Chemical Neuroanatomy,2008.227-238.

[4]Titus ADJ,Shankaranarayana R,Harsha HN.Hypobaric hypoxia induced dendritic atrophy of hippocampal neurons is associated with cognitive impairment in adult rats[J].Neuroscience,2007.265-278.

[5]王景叶,于榕,姚明辉.红景天苷对缺血再灌注大鼠脑组织损伤的保护作用[J].中华中医药杂志,2010,(03):456-459.

[6]陈霞,周松林,顾晓松.红景天苷对谷氨酸损伤海马神经元的保护作用[J].解剖学报,2008,(03):355-359.