RKIP在胆总管结扎肝纤维化大鼠肝脏组织的表达

　　作者：马俊骥 姜慧卿 李芳芳 崔东来 刘 丽 扈彩霞 张杰英2 作者单位：(河北医科大学第二医院消化内科，河北 石家庄 050000)

　　【摘要】 目的 研究RKIP在胆总管结扎肝纤维化大鼠肝脏组织中的表达。方法 SD大鼠60只，随机分为模型组(48只)、对照组(12只)。运用胆总管结扎方法制作大鼠肝纤维化模型，模型组分别于结扎后1、2、3、4 w麻醉动物，假手术组与4 w模型组同批麻醉，留取肝脏标本。组织切片经HE和Masson三色染色检测病理变化，Western印迹和免疫组织化学方法检测RKIP在肝组织的表达，用Western印迹方法检测RKIP和ERK的磷酸化水平。结果 HE和Masson三色染色结果证明胆总管结扎大鼠肝纤维化模型制作成功。随着肝纤维化程度增高RKIP表达下降，RKIP和ERK的磷酸化水平则相应增加。结论 胆总管结扎大鼠肝纤维化过程中肝脏组织Raf1/MEK/ERK1,2信号转导途径的激活与RKIP的蛋白表达下降和磷酸化增加有关。

　　【关键词】 RKIP;ERK;肝纤维化

　　【Abstract】 Objective To study Raf kinase inhibitor protein (RKIP) expression in liver of hepatic fibrosis rats induced by common bile duct ligation. Methods Hepatic fibrosis model was induced in SpragueDawley rats by common bile duct ligation (BDL). Livers in model group were harvested at 1, 2, 3 and 4 w after operation. Livers in sham operation group were harvested at 4 w after operation. Histopathological changes were evaluated by hematoxylin and eosin (HE) staining and by Masson′s trichrome method. RKIP expression and phosphorylation of RKIP and ERK in the livers were determined by Western blot, while the distribution of RKIP in the livers was assessed by immunohistochemistry. Results HE and Masson′s trichrome staining showed the successfully established hepatic fibrosis rats by common bile duct ligation. RKIP expression was decreased following the changes of hepatic fibrosis. On the contrary, phosphorylation of RKIP and ERK in the livers was increased. Conclusions The activation of Raf1/MEK/ERK1,2 signaling pathway is correlated with decreased RKIP expression and increased phosphorylated RKIP in the livers of bile duct ligation rats.

　　【Key words】 RKIP; ERK; Hepatic fibrosis

　　Raf激酶抑制蛋白(Raf kinase inhibitor protein，RKIP) 是Yeung等〔1〕发现的一种在信号通路Raf1/MEK/ERK1,2中起负向调节作用的因子。研究证明，肝纤维化(HF)的发生发展与Raf1/MEK/ERK1,2信号通路的激活有密切的关系〔2，3〕，但是RKIP作为此信号通路的抑制因子在肝纤维化进程中的作用机制目前尚未见报道。本实验采用Western印迹法和免疫组化法，研究RKIP在肝脏组织的表达情况，旨在为阐明肝纤维化形成的分子机制提供一定的理论依据。

　　1 材料与方法

　　1.1 动物 选用8周龄健康雄性SD大鼠60只，体重200～250 g，清洁级，由河北医科大学实验动物中心提供(DK04100054)。

　　1.2 试剂 山羊抗RKIP，兔抗phosphoRKIP (Ser 153)和小鼠抗βactin均购自美国Santa Cruz公司，兔抗ERK和兔抗phosphoERK (Thr 202/Tyr 204)购自美国Chemicon International公司。免疫组织化学Tris/EDTA修复液(pH9.0)和SP试剂盒购于北京中杉金桥生物技术有限公司。

　　1.3 方法

　　1.3.1 模型制作 采用胆总管结扎方法建立大鼠肝纤维化模型〔4〕。模型组(n=48),假手术组(n=12),分别于结扎后1、2、3和4 w麻醉动物,假手术组与4 w手术组同批麻醉。无菌条件下切开皮肤进入腹腔，立即留取左叶肝组织50 mg在液氮中速冻，于-70℃低温冰箱保存以备提取组织蛋白;再切取部分肝脏左叶，约5 mm×5 mm×5 mm，以4%多聚甲醛固定，常规石蜡切片，用于HE染色、Masson三色染色和免疫组织化学检测。肝组织均取自肝左叶的相同部位。

　　1.3.2 组织病理学染色 组织切片HE常规染色和Masson三色染色用于肝脏形态学观察〔5〕。

　　1.3.3 免疫组织化学 按照SP试剂盒操作说明进行，石蜡切片常规脱蜡、水化，置1 mmol/L Tris/EDTA缓冲液中进行微波抗原修复，凉至室温;30 g/L H2O2孵育10 min以消除内源性过氧化物酶活性，滴加100 mL/L正常兔血清封闭非特异性抗原;倾去血清，滴加1:100稀释的RKIP一抗，4℃放置过夜，PBS冲洗3×5 min，滴加生物素化二抗，37℃孵育10 min，PBS冲洗3×5 min;滴加辣根过氧化物酶标记的卵白素工作液，37℃孵育15 min;DAB显色，苏木素复染，脱水中性树脂封片。

　　1.3.4 Western 印迹法检测 从-70℃低温冰箱中取出大鼠肝组织50 mg，加入0.5 ml预冷的RIPA裂解液在冰浴中匀浆30 min，4℃10 000 r/min离心15 min后取上清，用Braford法测总蛋白含量。按每孔100 μg计算样品的上样量，将蛋白样品与上样缓冲液以4:1的比例混匀，煮沸5 min加在上样孔中，进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDSPAGE)，分离胶的浓度为12%。用0.22 μm PVDF膜进行冰浴转膜，取出膜用5%脱脂奶粉在室温下封闭4 h。4℃下一抗封闭过夜。二抗室温封闭2 h。在暗室中滴加ECL试剂反应3 min，曝光、显影和定影。显影条带经香港基因公司G:BOX凝胶成像分析仪采集后，用美国NIH ImageJ 1.38软件进行定量分析。RKIP和ERK以βactin作为内参照，pRKIP和pERK分别以RKIP和ERK作为内参照，结果以目的条带和内参照的光密度百分比表示。

　　1.4 统计学处理 数据均用x±s表示，用SPSS 10.0软件进行统计分析。

　　2 结 果

　　2.1 一般情况 大鼠造模4 w后肝脏肉眼观察呈褐绿色或棕色，表面略呈细颗粒状，质地变硬。组织病理学HE及Masson三色染色显示，假手术组肝小叶结构完整，肝板排列整齐。造模1 w肝组织出现散在性变性、坏死和大量炎细胞浸润，门管区小叶周边出现小胆管样上皮细胞增生;造模2 w肝板正常排列消失，小叶结构紊乱，门管区小胆管广泛增生，向小叶内延伸使肝小叶呈花环状，新生小胆管周围纤维组织增生，门管区面积扩大，肝小叶内亦有纤维组织增生;造模3～4 w大量胶原沉积在小胆管周围，肝脏广泛纤维结缔组织增生，增生的纤维间隔互相连接、包绕、分割，改建原来的肝小叶甚至形成假小叶。

　　2.2 RKIP在大鼠肝组织的免疫组化定位 RKIP在正常大鼠肝组织的肝细胞、胆管周围细胞、血管内皮细胞和肝窦周围细胞中均有表达，分布在细胞胞浆和胞膜;随着肝纤维化的发展，大鼠肝脏中RKIP阳性细胞明显减少，与肝细胞相比RKIP在汇管区和纤维间隔的成维细胞中表达较少，但在肝细胞胞膜中的表达增强。造模1～4 w大鼠肝组织RKIP的阳性面积占总面积的百分比分别为(87.1±1.4)%，(77.2±2.2)%，(60.9±2.3)%和(48.2±2.2)%;2～4 w大鼠肝组织RKIP的表达显著性低于正常对照组〔(89.2±1.3)%〕(P<0.05)(图1)。

　　2.3 肝纤维化不同时间点RKIP的动态表达及pRKIP和pERK的表达 Western印迹法分析显示，RKIP在模型组3～4 w肝纤维化组织的表达较假手术组下降，假手术组为(105.7±4.9)%，模型组1～4 w其表达分别为(104.0±4.2)%、(103.1±3.5)%、(54.5±2.8)%和(41.0±1.8)%。ERK的相对表达量没有明显变化，假手术组表达为(66.8±2.3)%，模型组1～4 w其表达分别为(70.4±2.3)%、(69.3±2.0)%、(68.1±1.4)%和(67.4±2.4 )%。随着肝纤维化的发展，RKIP和ERK的磷酸化水平逐渐增多。假手术组pRKIP表达为(12.4±1.9)%，模型组1～4 w其表达分别为(43.6±2.2)%、(45.0±2.6)%、(83.9±2.9)%和(89.7±3.5)%。pERK假手术组表达为(25.8±3.2)%，模型组1～4 w其表达分别为(95.5±3.8)%、(132.1±2.7)%、(277.7±4.8)%和(332.9±2.4)%(图2)。

　　3 讨 论

　　肝纤维化的主要病理学特征系慢性肝实质炎症、坏死，肝脏ECM合成增加，降解减少，代谢平衡紊乱〔6，7〕，导致肝脏内胶原过度沉积和结构紊乱。本实验应用BDL方法成功建立了胆汁淤积性肝纤维化大鼠模型，并且通过HE和Masson三色染色技术证实，随着BDL造模时间延长，肝组织病理学改变加重。

　　肝组织损伤局部ECM成分改变，肝星状细胞(hepatic stellate cells，HSCs)通过自分泌或旁分泌分泌TGFβ1、PDGF和EGF等多种细胞因子，这些细胞因子均可促使Raf1/MEK/ERK1,2的级联活化，刺激HSCs活化转变为肌成纤维细胞，从而具有增殖、合成大量ECM、舒缩功能改变、黏附和定向迁移能力等。由此可见肝纤维化的发生发展与Raf1/MEK/ERK1,2信号通路的激活有密切的关系〔2，3〕。

　　RKIP是一个在信号通路Raf1/MEK/ERK1,2中起负向调节作用的因子，RKIP通过与Raf1结合阻止Raf1磷酸化和激活MEK〔1〕。RKIP的表达缺失可以促进前列腺癌、黑色素瘤、乳腺癌、肝癌和肺癌细胞的增殖与转移，而RKIP的过表达可以抑制癌细胞的侵袭〔8，9〕。与抑制癌细胞迁移的研究结果不同，Zhu等〔10〕利用犬肾(MadinDarby canine kidney，MDCK)表皮细胞研究发现，RKIP可以促进表皮细胞转化为成纤维细胞增强其迁移能力，是细胞迁移运动的一个重要调节分子。本实验通过免疫组织化学发现随着肝纤维化的逐步进展，RKIP染色阳性面积逐渐下降，即随着肝纤维化程度的增高，RCIP在肝组织的蛋白表达量在下降。但是RKIP在肝细胞的表达强度相对于假手术组无明显变化，只是在肝纤维化组织的相对表达量却明显减弱，说明RKIP的蛋白表达量下降主要是由于肝纤维化组织的明显增加造成的。据此本文推测RKIP蛋白表达量下降可能与肝纤维化过程中成纤维细胞的大量增殖和迁移有关，这有待进一步证明。

　　本文进一步通过免疫印迹方法研究证实，随着肝纤维化的不断加重，RKIP在模型组3 w和4 w的肝组织蛋白表达量明显下降，而RKIP的磷酸化水平从模型组1 w即开始增加。磷酸化的ERK是其行使信号传递功能的活性形式，免疫印迹方法显示在肝纤维化的进展过程中确实伴随着ERK的磷酸化水平明显增加，说明在肝纤维化过程中Raf1/MEK/ERK1,2信号转导途径的激活与RKIP的蛋白表达下降和磷酸化增加有关。

　　综上，我们认为RKIP在肝纤维化形成过程中表达下降导致Raf1/MEK/ERK1,2信号转导通路活性增强，这可能与肝纤维化过程中成纤维细胞的大量增殖和迁移有关。本实验通过研究肝纤维化大鼠模型Raf1/MEK/ERK1,2信号转导通路抑制剂RKIP变化情况，从而为肝纤维化形成的分子机制研究提供新的理论依据，也为肝纤维化治疗揭示新的可能靶点。

　　【参考文献】

　　1 Yeung K，Seitz T，Li S,et al.Suppression of Raf1 kinase activity and MAP kinase signalling by RKIP〔J〕.Nature，1999;401:1737.

　　2 BenitezRajal J，Lorite MJ，Burt AD,et al.Phospholipase D and extracellular signalregulated kinase in hepatic stellate cells：effects of plateletderived growth factor and extracellular nucleotides〔J〕.Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol,2006;291(5)：G97786.

　　3 Jiang MD，Zheng SM，Xu H,et al.An experimental study of extracellular signalregulated kinase and its interventional treatments in hepatic fibrosis〔J〕.Hepatobiliary Pancreatic Dis Inter,2008;7:517.

　　4 姜慧卿，王占魁，张晓岚，等.丹参单体IH7643对胆总管结扎大鼠胶原降解的作用及其机制〔J〕.胃肠病学和肝病学杂志，2003;12(4):3369.

　　5 王玉珍，姜慧卿，扈彩霞，等.大鼠肝纤维化组织信号分子RhoA和肌球蛋白轻链的动态表达〔J〕.基础医学与临床，2007;27(3):2758.

　　6 Hui AY，Friedman SL.Molecular basis of hepatic fibrosis〔J〕.Exp Rev Mol Med，2003;5(5)：123.

　　7 姜慧卿，姚希贤.肝星状细胞的活化与肝纤维化〔J〕.胃肠病学和肝病学杂志，2007;16(1):869.

　　8 Klysik J，Theroux SJ，Sedivy JM,et al.Signaling crossroads：The function of Raf kinase inhibitory protein in cancer，the central nervous system and reproduction〔J〕.Cell Signal，2008;20(1):19.

　　9 韩海勃，张志谦，赵 威.RKIP蛋白在多个人肺癌细胞系中的表达下调〔J〕.基础医学与临床，2007;27(8):84952.

　　10 Zhu S，Mc Henry KT，Lane WS,et al.A chemical inhibitor reveals the role of Raf kinase inhibitor protein in cell migration〔J〕.J Chem Biol，2005;12(9):98191.