原发性肝癌外周血白蛋白基因片段扩增的临床意义

　　作者：朱云松，杨大明，姚登福，孟宪镛，李玉明，钱俊波，王亚明，许利华 作者单位：1南通大学第二附属医院消化科 ，2南通大学附属医院， 南通 226001

　　【摘要】目的:探讨外周血白蛋白(Alb)基因在肝癌早期诊断和鉴别诊断中的临床价值。方法:以巢式聚合酶链反应(RT-PCR)扩增外周血中Alb的基因片段分析在原发性肝癌(HCC)、慢性肝病和非肝病患者外周血中血白蛋白基因表达。结果: 67例肝癌患者外周血中Alb基因的检出率为59.7%,明显高于肝硬化、慢性肝炎和肝外肿瘤组患者(P<0.01),但与急性肝炎组无明显差别(P>0.05);在Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ期肝癌中, Alb基因片段阳性率分别为33.3%、36.8%和76.9%;肝内有无转移的肝癌组间存在明显差异(P<0.05),尤其在伴有肝外远处转移的肝癌中, Alb基因全数阳性(100.0%)。结论:分析外周血中Alb基因有助于肝癌的诊断、肝癌远处转移判别的监测。

　　【关键词】 原发性肝癌 Alb基因 RT-巢式PCR

　　Clinic significance of the albumin gene fragment amplified in peripheral blood with hepatocellular carcinoma

　　ZHU Yunsong，YANG Daming，YAO Dengfu， et al (Department of Gastroenterology, The Second Affiliated Hospital of Nantong University，Nantong 226001)

　　[Abstract] Objective: To explore clinical values of peripheral blood albumin gene in early diagnosis and differential diagnosis of hepatocellular carcinoma (HCC). Methods: The Alb gene was amplified by nested reverse transcription polymerase chain reaction(RT-PCR) in patients with hepatocellular carcinoma, chronic liver or non-liver disease. Results: The positive rate of peripheral blood Alb gene fragments from 67 patients with HCC was 59.7%. It was significantly higher than that from the patients with liver cirrhosis (LC), chronic hepatitis (CH) and extrahepatic tumor (ET) (P<0.01), but there is no significant difference in positive rates of Alb-mRNA between HCC and acute hepatitis (AH). The Alb-mRNA was correlated with the stage of HCC and the presence of intrahepatic metastasis. The expression of Alb gene was 33.3% in I stage HCC, 36.8% in Ⅱ stage HCC and 76.9% in Ⅲ stage HCC. It was positive in all patients with extrahepatic metastasis(100%). Conclusion: The analysis of peripheral blood Alb gene is useful for diagnosis and differentiation of HCC and judgment extrahepatic metastasis.

　　[Key words] Hepatocellular carcinoma;Albumin gene;Nested reverse transcription polymerase chain reaction

　　原发性肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是临床最常见、治疗最难的恶性肿瘤,HCC切除和肝移植是治疗的最佳选择,但绝大多数患者在术后发生移植肝或远处复发,其原因是在术前未能检出微转移灶或术中肝癌细胞释放入血所致,因而如能早期准确地检出外周血或淋巴结转移灶,才能设法降低复发率提高生存率[1，2]。本研究以RT-巢式PCR方法分析肝病患者外周血中Alb-mRNA,以观察它们在肝癌诊断、肝癌远处转移判断的临床价值。

　　1 材料与方法

　　1.1 研究对象 门诊和住院患者中收集急性肝炎12例、慢性肝炎20例、肝硬化16例、肝癌67例(男61例，女6例，年龄25~81岁，平均49.8±11.4岁)和非肝肿瘤14例(肺癌和胃癌各5例，食管癌、胰腺癌、结肠癌和胆管癌各1例)。肝癌和肝炎的诊断分别按照全国肝癌防治协作组标准和1995年北京全国肝炎会议制定标准核实诊断。另从健康正常人中收集外周血标本20份作为对照。所有标本于清晨空腹采血5 ml，以肝素抗凝并及时存于4 ℃保存，作外周血有核细胞制备。所有研究对象均以放射免疫分析法检测血AFP浓度。

　　1.2 外周血有核细胞分离及总RNA制备 肝素抗凝血在2小时内以淋巴细胞分离液及密度梯度离心法分离外周血有核细胞。经生理盐水洗涤两次后进行有核细胞计数。置于无RNAase的匀浆器中,加入TRIzol 1.0 ml匀浆2分钟,提取总RNA,最后加入TE缓冲液100 μl，取部分RNA于UV-2201型紫外分光光度计上测A260，换算出总RNA浓度。经紫外分光扫描鉴定,已纯化的RNA未受到污染或降解，其余RNA置于-85 ℃保存备用。

　　1.3 巢式PCR引物设计 参照文献报道的人类白蛋白核苷酸序列,自行设计巢式PCR扩增引物，由中国科学院上海细胞研究所合成。设计扩增序列位于人类白蛋白基因的1385-1806号核苷酸序列之间。Alb外部引物：Alb-1 5'-AGAAAGTACCCCAAGTGTCAA-3'(nt，1385-1405), Alb-2 5'-AGCTGCGAAATCATCCATAAC-3'(nt,1786-1806);内部引物：Alb-3 5'-GTGTCAACTCCAACTCTTGTA-3'(nt,1398-1419)，Alb-4 5'-TCAAGATTTGTCTCTCCTTCT-3' (nt，1699-1720)。

　　1.4 逆转录巢式PCR扩增方法 肝细胞中总RNA先经随机引物(Promega)和逆转录酶(Gibco/BRL)合成Alb-cDNA，逆转录反应程序为：23 ℃，10分钟;42 ℃，60分钟;95 ℃，10分钟。逆转录结束后在PE480型DNA扩增仪上行巢式PCR扩增,PCR循环程序为:93 ℃，30秒;55 ℃，30秒;72 ℃，1分钟连续35个循环结束后,在72 ℃10分钟后于4 ℃保存。第一阶段PCR以外部引物(Alb-1,Alb-2)和cDNA为模板,扩增产物为422 bp;第二阶段PCR，以已扩增第一次PCR产物为模板和内部引物(Alb-3,Alb-4)进行扩增,最终PCR产物323 bp。

　　1.5 统计学方法 计量资料以x±s表示进行F检验，两两比较用q检验，计数资料用χ2检验，以P<0.05表示组间差异具有统计学意义。

　　2 结 果

　　2.1 外周血Alb基因扩增法灵敏度 以RT-巢式PCR法，对67例HCC外周血标本中有核细胞进行分离，分别应用了RT-PCR(一阶段)和RT-巢式PCR(二阶段)对其mRNA进行扩增分析。结果如图RT-PCR检出Alb基因的阳性率分别为5.9%(4/67);RT-巢式PCR对两者的检出阳性率分别为59.7%(40/67)，可见2种方法的扩增阳性率间存在非常明显的差异(P<0.05)。外周血中Alb基因的扩增区带，主要见于肝癌患者和急性肝炎患者。区带清晰未见非特异性扩增区带出现(见图2)。按肝癌组织中总RNA浓度为5 μg/μl标本,分别稀释102、103、104、105、106、107和108倍，以RT-巢式PCR进行扩增分析，可见在总RNA浓度为5 pg/μl以上时均可出现阳性。

　　2.2 肝病患者外周血中Alb基因的扩增分析 分别对肝病、肝外肿瘤和正常对照标本的外周血有核细胞中的Alb-mRNA进行了扩增分析(表1)。Alb基因片段的检出率在肝癌组为59.7%，明显高于除急性肝炎组外的其他各组。

　　2.3 Alb基因检出率与肝癌临床分期 在所分析肝癌患者中,对肝癌的临床分期、是否伴有肝内或肝外转移进行分组比较，其结果见表2。Alb基因片段阳性率，在Ⅰ期和Ⅱ期两肝癌组中未见明显差异,但在临床Ⅲ期肝癌患者中，Alb基因的检出率为76.9%(30/39)，显著高于Ⅰ期和Ⅱ期肝癌的检出率(P<0.05)。在伴有肝内转移组阳性率为71.4%(25/35)显著高于不伴有肝内转移组15%(15/32)(P<0.05)，尤其在肝外转移的所测4例肝癌中，基因标志均100%出现阳性区带。

　　2.4 Alb基因与肝癌大小的关系 在67例肝癌中按其瘤体大小分为两组:瘤体≤3 cm有9例，Alb基因片段阳性3例(33.3%);瘤体>3 cm有58例, Alb基因片段的检出率63.8%(37/58)，差异无统计学意义(P>0.05)。

　　3 讨 论

　　目前认为手术是治疗肝癌有效手段,但是由于部分肝癌患者术前血循环中已存在少量癌细胞,在机体免疫机能遭受破坏情况下,血中癌细胞得以增殖,仍有50%~70%的患者在术后发生移植肝或远处复发，复发率高，甚至小肝癌亦如此。因此识别血循环中有无癌细胞,观察癌细胞动态变化,对指导临床治疗和判断预后具有重要意义。人类AFP基因和Alb基因串联排列于第4号染色体的长臂上; Alb基因由14个外显子组成, Alb启动子位于AFP增强子上游28 kb;AFP增强子作用是从AFP起动子转变到白蛋白启动子,两者表达调控存在密切关系。实验证实大鼠胚胎时期两基因均有较高表达，但出生后AFP表达迅速降低直至关闭;而Alb基因表达呈稳定升高。国内外多项研究表明外周血AFP-mRNA的变化与肝癌的转移及术后复发密切相关，是判断肝癌患者预后的重要指标之一。而患者外周血中检测出Alb-mRNA能否作为判断循环中有无癌细胞特异性标志物,尚有争议[2，3]。

　　本研究结果显示肝癌组Alb-mRNA阳性率59.7%(40/67),而肝硬化组和慢性肝炎组阳性率仅为25.0%(4/16)和20.0%(1/5)，肝外肿瘤和健康人群未发现1例阳性。同时，我们也注意到在急性肝炎组12例患者中有8例Alb-mRNA阳性(66.7%)。除了急性肝炎组外,其它各组阳性率与HCC组比较，差别有显著性。随着临床分期不同，其中Ⅲ期HCC明显高于Ⅰ、Ⅱ期，差异均有统计学意义。4例有远处转移者中2例椎骨转移,1例肺转移,1例腹腔淋巴结转移, Alb-mRNA均阳性(100%)。结果表明Alb-mRNA阳性率与疾病严重程度有关,晚期伴有肝内转移者明显高于早期不伴有肝内转移者，提示在肝细胞发生癌变时,肝细胞表达Alb也随之发生改变，Alb-mRNA与肝癌转移和复发可能有一定关系。肝细胞癌变和转移是一个极其复杂的过程,有多种因素参与;大量实验证实，肝癌组织中血管内皮生长因子(VEGF)-mRNA表达和血浆VEGF均明显升高,VEGF能够促进肝癌组织血管生成,增加血管通透性,使得肿瘤细胞或正常肝细胞更易脱落进入血循环[2]。半定量RT-PCR分析也证实肝癌患者外周血Alb-mRNA含量高于对照组。进一步研究发现,在肿癌直径≤3 cm与>3 cm的两组HCC患者中，外周血Alb -mRNA阳性率无显著性差别(P>0.05);提示其阳性率与肿瘤大小无关,即使小肝癌也可能存在血行播散,发生微小转移灶。由于白蛋白为肝细胞表达和分泌,白蛋白基因被认为是肝细胞一种特异性标志物。不排除在非HCC患者外周血中检测出Alb-mRNA, 其有可能来自正常肝细胞脱落入血循环[3~5]。急性肝炎时,Alb-mRNA阳性率增高可能由于急性炎症期间，一些肝细胞被释放到周围血中,也可能因肝细胞再生过程中,一些增生的肝细胞进入血循环。由于急性肝炎的临床特点及辅助检查结果均与肝癌有迥异，故不难与肝癌相鉴别。因此我们认为，检测外周血Alb-mRNA对诊断HCC和判断有无转移,仍不失为行之有效的方法之一。

　　【参考文献】

　　[1] Cheung ST, Fan ST, Lee YT, et al. Albumin mRNA in plasma predicts post-transplant recurrence of patients with hepatocellular carcinoma[J]. Transplantation，2008，85(1):81-87.

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