Klotho基因及其多态性的研究进展

　　作者：孟庆玲 黄曙 范志宁 作者单位：南京浦口医院消化内科，江苏 南京 210031

　　【关键词】 klotho基因; 多态性; 研究进展

　　Klotho基因是Kuro等〔1〕于1997年发现的与衰老有关的新基因，并用古希腊神话中纺织生命之线女神的名字命名。Klotho基因被敲除的小鼠(KL-/小鼠)可出现类似人类衰老的各种表型，如寿命缩短、不育症、动脉硬化、皮肤萎缩、骨质疏松、肺气肿等。近年来对klotho基因多态性与疾病的关系逐渐受到重视，现将有关研究现状综述如下。

　　1 Klotho基因的结构

　　Klotho基因长50 kb，由5个外显子和4个内含子组成〔2，3〕。人的klotho基因位于13q12，klotho基因的操纵子内没有TATA盒和CAAT盒，但有5个潜在的SP1结合位点，外显子1及旁侧2 000 bp序列中，G+C的平均含量为66.75%，最高达到98%，提示在这一区域有CpG岛的存在〔1，4〕。在klotho基因结构中，其RNA存在着一个潜在的可变剪切位点，这一位点如果接受了一个50 bp片段的插入，该插入序列末尾的两个核苷酸TA就会与外显子4的第一个核苷酸G共同构成一个终止密码TAG，使得RNA由此截断形成一个短的开放阅读框，仅含3个外显子和2个内含子而编码分泌型klotho蛋白。但如果可变剪切位点没有50 bp片段的插入，其RNA就是一个完整的结构，包括5个外显子和4个内含子，编码形成一种膜型klotho蛋白。人的膜型klotho cDNA全长3 036 bp，分泌型cDNA全长1 647 bp。膜型klotho基因表达的膜型蛋白是一种单跨膜蛋白，包括一个N端信号序列、带有两个内部重复片段的KL1和KL2细胞外区域，一个单跨膜区和一个短的胞内区。在KL1和KL2之间有一段LysLysArgLys的碱性氨基酸序列，可能为蛋白酶裂解位点，该位点有时可能被裂解，释放出小肽而作为体液因子发挥作用。而分泌型klotho基因表达的分泌型蛋白由于可变剪切的原因，仅含有N端序列和KL1胞外区，缺少了KL2胞外区、跨膜区和胞内区。人的膜型蛋白含有1 012个氨基酸，分泌型蛋白含有549个氨基酸。

　　2 Klotho基因多态性

　　Klotho 基因共含有400多个单核苷酸多态性(SNPs)，其中影响转录和蛋白表达的主要是启动子区和外显子区的SNPs，其中启动子区有 16个SNPs，5个外显子区共有15个SNPs，其余均在内含子内。目前研究最多的是KLVS〔5〕，包含6个SNPs，位于外显子2区附近，3个SNPs在外显子2区内，其中1个为无义突变，另两个F352V(A1056G) 和C370S(G1110C)，这6个SNPs处于完全连锁不平衡。KLVS具有明显的种族特异性，白种人群有 20%～31%的变异〔5，6〕，而日本和韩国等亚洲人群未发现变异〔7，8〕。其他如启动子395也存在GA变异，在正常人群中G、A的频率分别为80.4%～85.7%和14.3%～19.6% 〔7，9，10〕。该等位基因是Kawano等〔8〕在研究绝经后妇女骨密度时发现，电泳迁移率变动分析(EMSA)显示G→A替换后DNA蛋白复合物的量明显下降，推测该替换可能通过减少蛋白和klotho基因启动子区结合而改变klotho基因表达。外显子4区的C1818T(His→His)的变异，并不能引起氨基酸表达的改变，但可能也与某些疾病有关，多项研究表明〔11，12〕外显子区的无义突变也可能产生有异常功能的多种转录或影响产物的表达水平，Kawano等〔8〕用RTPCR方法没有发现C1818T变异引起的klotho基因转录的变化，推测C1818T位点可能与影响klotho基因功能的一个SNP位点有机联系在一起。在正常人群中C、T的频率分别为58.9%～81.9%和18.1%～41.1%〔7，10〕。klotho基因其他SNPs如启动子区G959C 、外显子1区A44C和C234G、外显子4区C2298T等，因未发现与疾病有关或小等位基因频率低于5%，在此不再赘述。

　　3 Klotho基因多态性与疾病易感性的关系

　　3.1 Klotho基因与心血管疾病

　　Klotho基因缺陷的小鼠在出生4 w后即可出现动脉硬化，并随着年龄的增加而加重，这些血管变化与人类动脉硬化非常相似。把外源性正常klotho cDNA转导给klotho基因缺陷的小鼠后，其动脉硬化程度可得到显著改善〔1〕，由此推测在人体也可能存在klotho基因突变或有特定的klotho等位基因与动脉硬化密切相关。为此，Arking等〔13〕检测了两组相互独立的无症状冠心病患者的KLVS等位基因频率，同时比较冠心病的危险因素如血糖、血脂、血压、体重指数、吸烟情况，经过Logistic回归分析，证实KLVS等位基因是早发冠心病的独立危险因素。随后他们〔14〕又检测了525例北欧犹太教徒的KLVS等位基因频率，并用多元回归法分析KLVS基因型与血压、血脂等心血管危险因素的关系，发现HDLC和收缩压与KLVS具有相关性，野生型(FF)和KLVS纯合型(VV)与杂合型(FV)相比，HDLC分别下降了3.47和9.80 mg/dl，收缩压升高6.51和 18.97 mmHg，提示KLVS纯合型患心血管疾病的危险度最高。用Cox回归分析，KLVS纯合型和野生型较杂合型相对危险度提高了4.49和2.15倍。以上报道均提示KLVS基因与心血管疾病密切相关。除KLVS基因外,在亚洲地区也进行了启动子区G395A与心血管疾病关系的研究其关系目前尚不明确。Imamura等〔9〕认为冠状动脉狭窄患者klotho基因395A等位基因频率(29.9%)明显高于对照组(19%)，调整后的P=0.029，而冠状动脉痉挛组(23.4%)与对照组无显著性差异，从而推测395A可能是冠心病独立的基因危险因子。而Rhee等〔15〕在对274例因胸痛进行冠状动脉造影检查的韩国人G395A分型中发现，冠心病患者携带A等位基因(GA+AA)的频率(45.1%)与非冠心病患者(54.9%)相比，两者无显著差异(P=0.746)，目前395A等位基因是否是冠心病筛选基因还有待大样本进一步证实。

　　3.2 Klotho基因与骨质疏松

　　人的骨质密度是基因和环境共同作用的结果，实际上Ralston等〔16〕认为基因在骨质密度方面可能起到50%～80%的作用，而且不同基因在不同年龄阶段起着不同作用。由于KL-/-小鼠可出现类似人类衰老的各种表型，包括骨质疏松，由此推测klotho基因多态可能与骨质疏松有关。Kawano等〔8〕研究报道在55例≥65岁绝经期妇女的小样中提示klotho基因可能与衰老有关的骨质疏松有关。Mullin等〔17〕报道与此相反，他们检测1 190例白种人绝经期妇女基因型及其各部位(包括髋骨、股骨颈、股骨粗隆和粗隆间)的BMD和其中200例降钙素，发现G395A和C1818T两基因多态与各部位的BMD无关,而C1818T多态与血清降钙素有关,TT型的降钙素明显大于CT型,CT型大于TT型。以上报道存在矛盾之处，提示G395A和C1818T多态与人体骨质密度(BMD)可能无关，还有待进一步研究。在T352V与BMD的关系方面，Zarrabeitia等〔18〕检测362位西班牙男性的F352V基因型和各部位(包括腰椎、股骨颈、髋骨和跟骨)的BMD，362位男性作为整体，FV+VV基因型的BMD与FF的无明显区别，≤53岁的中青年人群中，FV+VV基因型的BMD明显高于FF基因型的。Riancho等〔10〕则认为女性的F352V基因型和BMD的关系与绝经状态有关，绝经前F352V基因型和BMD无关，绝经后含FV+VV基因型的妇女BMD较含FF基因型的高。由此推测F352V多态与BMD可能有一定的关系。FF基因型可能是骨质疏松的危险因素。

　　3.3 Klotho基因与糖代谢

　　由于KL-/小鼠血糖和胰岛素水平下降且胰岛素敏感性增加，相反，klotho过表达的小鼠胰岛素抵抗，推测klotho基因可能与糖尿病有关。Rhee等〔19〕检测251例健康韩国妇女快速血糖和胰岛素抵抗指数(HOMAIR)并用RTPCR检测klotho基因型，发现G395A与血糖无关，而C1818T与血糖有关，含T等位基因血糖高于C等位基因，HOMAIR 平均值也明显增高，提示klotho基因可能是研究糖代谢的候选基因之一。Graham等〔20〕在对1 793例无糖尿病家族史的2型糖尿病患者、1 619例正常对照和来自509例2型糖尿病家庭的1 616例个体进行klotho基因F352V检测，证明糖尿病患者FV+VV基因型(28%)与正常对照(28%)无显著差异，用FBAT软件进行家系关联性分析，发现V等位基因与糖尿病并无明显关联，提示在大型病例对照研究和家系研究中并未发现klotho基因F352V与2型糖尿病有关。

　　3.4 Klotho基因与肿瘤

　　Klotho的功能目前研究较多的是：①klotho蛋白抑制氧化应激、提高哺乳动物细胞对氧化应激的抵抗能力〔21〕;②抑制参与肿瘤发生发展的IGF1R的作用〔22～25〕;③klotho基因缺乏的小鼠具有免疫抑制作用〔1，26〕。以上均提示klotho可能是一个肿瘤抑制因子〔27〕。Wolf等〔28〕在研究klotho蛋白的表达与肺癌的关系时发现klotho表达在正常肺组织较肺癌组织高,在癌组织中,癌块较小的肺癌组织klotho表达较较大的肺癌组织高,Wolf等的结论证实klotho可能是一个肿瘤抑制因子。然而 Lingeng 等〔29〕在研究卵巢癌与klotho蛋白表达的关系时发现卵巢上皮细胞癌组织klotho蛋白表达较正常组织增高，klotho表达可能与卵巢癌的进展有关,这一结论与Wolf等结果相矛盾。klotho蛋白与肿瘤的关系还待进一步研究。我们〔30〕在研究klotho基因多态与胃癌的关系时发现胃癌患者395A明显高于正常对照，这是首次关于klotho基因多态与肿瘤关系的研究。

　　4 展 望

　　Klotho是与衰老有关的新基因，目前其多态性与疾病易感性的研究主要集中在心血管、骨质疏松和糖代谢方面的研究，而与肿瘤和免疫功能关系的研究较少。有关klotho基因多态性与疾病的关系研究也应考虑这些方面。klotho基因功能与各种老年性疾病关系的研究帮助我们阐明衰老的分子机制及内在本质，为更好防治衰老性疾病、延长人类寿命奠定基础。

　　【参考文献】

　　1 Kuroo M，Matsumura Y，Aizawa H,et al.Mutation of the mouse klotho gene leads to a syndrome resembling aging〔J〕.Nature,1997;390:4551.

　　2 Matsumura Y，Aizawa H，ShirakiIida T,et al.Identification of the human klotho gene and its two transcripts encoding membrane and secreted klotho protein〔J〕.Biochem Biophys Res Commun，1998;243(3):62630.

　　3 Saito Y，Kuroo M，Nabeshima Y,et al.The protective role of klotho gene on vascular endothelium〔J〕.Nippon Rinsho,1999;57(7):15148.

　　4 ShirakiIida T，Aizawa H，Matsumura Y,et al.Structure of the mouse klotho gene and its two transcripts encoding membrane and secreted protein〔J〕.FEBS Lett,1998;424(12):610.

　　5 Arking DE，Krebsovs A，Macek M Sr，et al.Association of human aging with a functional variant of klotho〔J〕.Proc Natl Acad Sci USA，2002;99：85661.

　　6 Low AF，O′Donnel CJ，Kathiresan S，et al.Aging sysdrome genes and premature coronary artery disease〔J〕.BMC Med Genet,2005;6:3846.

　　7 Kim Y，Kim JH，Nam YJ,et al.Klotho is a genetic risk factor for ischemic stroke caused by cardioembolism in Korean females〔J〕.Neurosci Lett,2006;407(3):189194.

　　8 Kawano K，Ogata N，Chiano M,et al.Klotho gene polymorphisms associated with bone density of aged postmenopausal women〔J〕.J Bone Miner Res，2002;17:174451.

　　9 Imamura A，Okumura K，Ogawa Y,et al.Klotho gene polymorphism may be a genetic risk factor for atherosclerotic coronary artery disease but not for vasospastic angina in Japanese〔J〕.Clin Chim Acta,2006;371:6670.

　　10 Riancho JA，Valero C，Hernandez JL,et al.Association of the F352V variant of the klotho gene with bone mineral density〔J〕.Biogerontology，2007;8：1217.

　　11 Wakamatsu N，Kobayashi H，Miyatake T,et al.A novel exon mutation in the human betahexosaminidase beta subunit gene affects 3，splice site selection〔J〕.J Biol Chem，1992;267:240613.

　　12 Liu W，Qian C，Francke U.Silent mutation induces exon skipping of fibrillin1 gene in Marfan syndrome〔J〕.Nat Genet，1997;16:3289.

　　13 Arking DE,Becker DM，Yanek LR,et al.Klotho allele status and the risk of earlyonset occult coronary artery disease〔J〕.Am J Hum Genet，2003;72:115461.

　　14 Arking DE,Atzmon G，Arking A,et al.Association between a functional variant of the klotho gene and highdensity lipoprotein cholesterol,blood pressure，stroke，and longevity〔J〕.Circ Res,2005;96:4128.

　　15 Rhee EJ，Oh KW，Lee WY,et al.The differential effects of age on the association of klotho gene polymorphisms with coronary artery disease〔J〕.Metabolism,2006;55:134451.

　　16 Ralston SH.Genetic control of susceptibility to osteoporosis〔J〕.J Clin Endocrinol Metab，2002;87:24606.

　　17 Mullin BH，Wilson SG,Islam FM,et al.Klotho gene polymorphisms are associated with osteocalcin levels but not bone density of aged postmenopausal women〔J〕.Calcif Tissue Int,2005;77:14551.

　　18 Zarrabeitia MT，Hernandez JL，Valero C,et al.Klotho gene polymorphism and male bone mass〔J〕.Calcif Tissue Int,2007;80:104.

　　19 Rhee EJ，Oh KW，Yun EJ,et al.Relationship between polymorphisms G395A in promoter and C1818T in exon 4 of the KLOTHO gene with glucose metabolism and cardiovascular risk factors in Korean women〔J〕. J Endocrinol Invest，2006;29:6138.

　　20 Rachel MF，Michael NW，David M,et al.The functional “KLVS” variant of KLOTHO is not associated with type 2 diabetes in 5028 UK Caucasians〔J〕.BMC Medical Genetics，2006;7:51.

　　21 Yamamoto M，Clark JD，Pastor JV,et al.Regulation of oxidative stress by the antiaging hormone klotho〔J〕.J Biol Chem,2005;280:3802934.

　　22 Stromberg T，Ekman S,Girnita L,et al.IGF1 receptor tyrosine kinase inhibition by the cyclolignan PPP induces G2/Mphase accumulation and apoptosis in multiple myeloma cells〔J〕.Blood，2006;107(2):66978.

　　23 Ahlen J，Wejde J，Brosjo O,et al.Insulinlike growth factor type 1 receptor expression correlates to good prognosis in highly malignant soft tissue sarcoma〔J〕.Clin Cancer Res，2005;11(1):20616.

　　24 Kucab JE，Dann SE. Role of IGF1R in mediating breast cancer invasion and metastasis〔J〕.Breast Dis，2003;17:417.

　　25 Kurosu H，Yamamoto M，Clark JD,et al.Suppression of aging in mice by the hormone klotho〔J〕.Science,2005;309(5742):182933.

　　26 Yamashita T，Yoshitake H，Tsuji K,et al.Retardation in bone resorption after bone marrow ablation in klotho mutant mice〔J〕.Endocrinology，2000;141(1)：43845.

　　27 Wang YA.Klotho，the long soughtafter elixir and a novel tumor suppressor〔J〕? Cancer Biol Ther,2006;5(1):201.

　　28 Wolf I，LevanonCohen S，Bose S,et al.Klotho：a tumor suppressor and a modulator of the IGF1 and FGF pathways in human breast cancer〔J〕. Oncogene,2008;27(56):7094105.

　　29 Lu L，Katsaros D，Wiley A,et al.Klotho expression in epithelial ovarian cancer and its association with insulinlike growth factors and disease progression〔J〕.Cancer Invest，2008;26:18592.

　　30 孟庆玲,黄 曙,范志宁,等.Klotho基因G395A和C1818T多态性与胃癌遗传易感性的研究〔J〕.南京医科大学学报(自然科学版),2008;28(10):125862.