PPARα在老年大鼠酒精性肝损伤脂质过氧化中的作用

　　作者：孙龙 张填 杨世忠 作者单位：海南医学院附属医院消化内科，海南 海口 570102

　　【摘要】目的 探讨过氧化物酶体增殖物激活受体α(PPARα) 在老年酒精性肝损伤中的作用。方法 将60只Wistar老年大鼠随机分为5组：对照组1组、观察组4组(包括4 w组、8 w组、12 w组和16 w组)。参照相关文献，观察组各组大鼠用白酒灌胃法复制酒精性肝损伤动物模型，分别于开始造模后的第4、8、12、16周时处死各组动物，采用RTPCR法检测肝组织中PPARα的表达，并检测脂质过氧化指标(血清FFA水平、肝组织中MDA含量及SOD活力)变化，分析PPARα的表达与其他各项指标的相关性。结果 与正常组比较，观察组各组大鼠PPARα的表达受抑制，随造模时间的延长，其表达水平逐渐降低，特别是在12、16 w时更为明显(P<0.05,P<0.01);而血清FFA水平、肝组织中MDA含量逐渐升高，肝组织中SOD活力逐渐降低。相关性分析表明，PPARα的表达与血清FFA水平、肝组织中MDA含量之间存在一定的效应关系，呈负相关，而与肝组织中SOD活力呈正相关。结论 PPARα与脂质过氧化关系密切，在老年酒精性肝损伤的发病机制中具有重要作用。

　　【关键词】 酒精性肝损伤;过氧化物酶体增殖物激活受体α;脂质过氧化

　　过氧化物酶体增殖物激活受体(peroxisome proliferator activated receptors，PPARs)属调节目标基因表达的核内受体转录因子超家族成员，活化后具有多种生物学效应〔1〕。近年来研究发现，作为PPARs的亚型之一，PPARα具有调节脂肪代谢、炎症反应、免疫功能、细胞分化等作用，与多种肝脏疾病关系密切。笔者在以往动物实验中初步证实PPARα在酒精性肝损伤中表达受抑制，其基因表达水平与NFκB(P65亚型)的表达、血清TNFα及IL6水平呈负相关，提示PPARα在酒精性肝损伤炎症反应中具有重要作用〔1〕。本实验拟采用RTPCR法观察PPARα在老年大鼠酒精性肝损伤中的表达变化及其与脂质过氧化的关系，进一步探讨PPARα在酒精性肝损伤中的意义。

　　1 材料与方法

　　1.1 实验动物分组

　　健康老年Wistar雄性大鼠(22月龄)60只，随机分为5组：对照组1组，观察组1～4组，每组12只。观察组根据造模时间的不同分为4、8、12、16 w组。实验期间各组大鼠均予以饮用水及全价营养颗粒饲料喂养。

　　1.2 动物模型建立

　　大鼠经适应性喂养1 w后，观察组参照相关文献造模〔2〕：用红星牌二锅头白酒(北京酿酒总厂生产，约为10.2 mmol/L酒精溶液)，以1.5 ml/100 g体重的剂量灌胃1次/d，分别连续灌胃4、8、12、16 w。对照组以等剂量的0.9%氯化钠溶液灌胃1次/d。

　　1.3 标本制备

　　各组大鼠分别于造模4、8、12、16 w末，禁食12 h，水合氯醛麻醉动物，下腔静脉采血，分离血清，用于检测血清游离脂肪酸(FFA);并于肝右叶取部分新鲜肝组织在4℃下制成肝组织匀浆，经高速离心后取其上清液，用于检测肝组织中丙二醛(MDA)含量及超氧化物歧化酶(SOD)活力;另一部分经液氮速冻，-80℃冰箱保存，以提取总RNA，用于RTPCR方法检测PPARα mRNA表达情况。

　　1.4 血清FFA水平测定

　　采用比色法测定血清FFA水平，严格按照FFA测试试剂盒(南京建成生物工程公司提供)说明进行操作。

　　1.5 MDA含量、SOD活力测定

　　取制备好的肝组织匀浆，严格按照MDA、SOD测试试剂盒(南京建成生物工程公司提供)说明进行操作。

　　1.6 RTPCR

　　总RNA提取试剂盒(美国BBI公司产品);RTPCR 试剂盒(日本TaKaRa Biotech公司产品);PCR引物经Primer5.0软件设计，由沈阳联星生物技术有限公司合成并纯化，见表1。表1 目的基因引物序列及反应条件(略)

　　肝组织总RNA严格按照总RNA提取试剂盒操作说明进行提取，变性琼脂糖电泳法检测RNA的完整性，以随机引物逆转录合成cDNA，-80℃冰箱保存备用。

　　根据RTPCR试剂盒要求加入相应成分，构成反应体系。将反应体系放于RTPCR仪中进行扩增反应，RTPCR反应参数：94℃预变性10 s，然后94℃变性15 s，62℃退火及聚合1 min，共45个循环。在每个循环进行到62℃时进行荧光定量检测。反应完毕后，采用2%琼脂糖电泳检测产物的单一性。每组实验至少平行重复2～3次。选取2～6循环作为基线范围，值为0.8时作为阈值，得到各个RTPCR扩增反应的CT值，最后采用△△CT法计算公式得到观察组各组与正常组之间mRNA表达量的相对比值。

　　相对含量%=2-△△CT

　　△△CT=△CT待测样品-△CT对照样品

　　1.7 统计学处理

　　采用SPSS12.0统计软件包，计量资料组间比较采用q检验，相关性采用直线回归分析。

　　2 结 果

　　2.1 一般状况

　　实验过程中，观察组大鼠因灌胃误入气管或胃穿孔(经解剖证实)共死亡10只，其中4、8 w组各死亡2只， 12、16 w组各死亡3只，对照组无大鼠死亡，经统计学分析，各组之间无显著性差异(P>0.05)，具有可比性。

　　2.2 血清FFA水平及肝脏MDA、SOD变化

　　随造模时间延长，观察组大鼠血清FFA水平呈进行性升高，与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。随造模时间延长，观察组大鼠肝组织中MDA含量呈进行性升高，而SOD活力呈进行性下降，与对照组比较差异均有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。见表2。表2 各组大鼠血清FFA水平及肝组织MDA含量、SOD活力比较(略)

　　2.3 RTPCR结果

　　RTPCR反应的融解曲线表明引物特异性良好;扩增反应的扩增曲线表明扩增反应良好。见图1、图2。

　　2.4 各组大鼠肝脏组织中PPARα mRNA表达

　　见表3。随造模时间的延长，观察组各组大鼠肝组织中PPARα的基因表达(相对比值)逐渐减弱，与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)，其中造模12、16 w更为明显(P<0.01)。表3 各组大鼠肝组织中PPARα的基因表达(略)

　　2.5 PPARα的基因表达与FFA水平、MDA含量、SOD活力的相关性分析

　　见表4。观察组中各组大鼠PPARα的基因表达与血清FFA水平之间均存在良好的效应关系，呈负相关。观察组中各组大鼠PPARα的基因表达与肝组织中MDA含量之间均存在良好的效应关系，呈负相关;而PPARα的基因表达与肝组织中SOD活力呈正相关。表4 PPARα的基因表达与血清FFA水平相关性分析(略)

　　3 讨 论

　　酒精性肝损伤的致病因素单一明确，即长期大量的酒精摄入，但发病机制较为复杂，可能与酒精及其代谢产物的毒性作用、氧化应激、免疫介导和细胞因子、细胞凋亡、内毒素等多种因素有关〔3〕。目前，氧化应激与脂质过氧化在酒精性肝损伤发病机制中的作用备受关注，是酒精诱导肝细胞损伤的主要作用机制之一〔4，5〕。酒精在肝细胞内可通过细胞色素CYP4502E1并在铁离子参与下产生氧化作用，生成大量自由基，激活磷脂酶及脂质过氧化反应，降低膜磷脂，改变其通透性和流动性，从而改变与膜结合的酶、受体和离子通道的微环境，影响其功能〔6〕。此外，脂质过氧化还可以影响DNA和蛋白质的结构及功能〔7〕。近年来研究证实，PPARα表达减少可以使肝脏中脂质的利用和脂肪酸的氧化均发生障碍，导致肝脏内脂肪蓄积〔8〕。酒精可以使大鼠肝脏出现脂肪变性和炎症反应，同时PPARα所调控的肝脂肪酸结合蛋白基因表达下降，而PPARα激动剂可以改善脂肪变性、逆转炎症、上调相关基因的表达〔9〕。提示PPARα的表达与氧化应激及脂质过氧化关系密切，在酒精性肝损伤中具有重要作用。

　　本实验发现随造模时间的延长，血清FFA水平、肝组织中MDA含量逐渐升高，而肝组织中SOD活力逐渐减弱，进一步证实氧化应激与脂质过氧化在酒精性肝损伤中具有重要作用，与其他学者研究结论相一致〔4，5〕。同时，经RTPCR方法证实PPARα在酒精性肝损伤中表达受抑，随造模时间延长其表达水平进行性降低，且表达水平与血清FFA水平、肝组织中MDA含量呈负相关，与肝组织中SOD活力呈正相关。结合以往实验研究结论，笔者认为氧化应激与脂质过氧化在酒精性肝损伤中具有重要作用，特别在老年性酒精性肝损伤中其作用更为明显。同时，PPARα参与了酒精性肝损伤，并在其病理过程中具有重要作用。PPARα的表达受抑，不仅可以使NFκB活化，启动多种炎性细胞因子的过量表达，放大炎症反应，促进酒精性肝损伤的发生和发展〔1〕;同时，也可能引起一系列与肝内脂肪酸代谢有关的蛋白质、酶基因的转录水平降低，使脂肪酸在肝脏内的氧化减少，脂蛋白合成代谢障碍，肝细胞内出现脂肪沉积及炎症反应，从而导致酒精性肝损伤的发生和发展。但PPARα参与氧化应激及脂质过氧化确切的作用途径、机制尚未完全明确，有待于进一步研究。

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