Klotho基因功能研究进展

　　作者：郜茜 作者单位：青海大学附属医院消化科

　　【关键词】 基因功能

　　Klotho(Kl)基因是由Kuro-o等[1]在1997年研究自发性高血压时偶然发现的，后确认Klotho基因缺失鼠(Kl-/-)的表型类似人类的衰老表现，包括寿命缩短、动脉硬化、皮肤肌肉萎缩、认知障碍、运动神经元受损、软组织钙化、听力下降、骨质疏松[2～4]。反之，Klotho基因高表达可延长实验动物的寿命[2]，说明它是一个衰老抑制基因。当Kl表达异常时，出现一系列与衰老及与衰老密切相关的疾病[5]，提示Klotho基因在衰老和衰老相关疾病的发生中起着重要作用。同时在一些病理状态下，Kl表达变化也和疾病的发展、预后密切相关。近年研究发现，Kl抗衰老的作用主要是通过抗氧化、抗凋亡功能实现的，本文就这方面研究作一综述。

　　1 Kl的一般生物学特点

　　Kl基因1997年由Kuro-o等[1]首先从表现为衰老的模型小鼠中克隆成功，随后发现人和大鼠中也存在Kl基因，且它们之间具有较高的同源性(83%)。Kl基因在人和小鼠中均定位于第13号染色体(13q12)，基因全长50 kb，包含5个外显子，可通过选择性拼接产生两种蛋白产物上，一种为膜型Kl蛋白，人的膜型Kl蛋白全长有1012个氨基酸残基(小鼠为1024个)，为跨膜蛋白，该类型主要在肾脏、胎盘、小肠和前列腺中表达;另一种为分泌型Kl蛋白，人的分泌型Kl蛋白全长有549个氨基酸残基(小鼠为550个)，该类型缺乏跨膜结构和胞内结构，它以游离的形式发挥功能，在人的大脑、海马、胎盘、肾脏、前列腺和小肠等组织中均检测到其存在，在血清中也检测到Kl蛋白的存在[6]。目前认为血循环中的Kl蛋白作为一种激素参与对机体功能的调节，它可与细胞表面的受体结合，抑制细胞内胰岛素和胰岛素样生长因子-1(insulin/IGF)的信号转导通路，对多种靶器官发挥生理效应[7]。

　　2 Kl基因的抗氧化作用及抗凋亡作用

　　活性氧簇(Reactive oxygen species，ROS)在缺血、中毒、免疫等因素介导的组织损伤中的作用日益引起人们的重视，氧化应激是缺血再灌注引起急性肾损伤的一个重要原因[8]。动物实验和体外实验都证实了ROS在组织损伤中的作用，并把清除氧自由基作为治疗的重要方法之一。有研究表明动物在应激状态下体内Kl mRNA和蛋白表达下降。Mitobe等[9]对小鼠肾脏内髓集合管3细胞(Mouse inner medullary collecting duct 3 ，mIMCD 3)进行培养观察发现，在过氧化氢(H2O2)诱导的氧化应激状态下Kl表达降低，凋亡细胞数目增加，并且这种改变和剂量、时间的变化呈正相关，可将其作为氧化应激状态下组织细胞凋亡的一个指标[10]。Haruna,Y[11]等发现肾小球肾炎的小鼠动物模型在40周时肾组织凋亡细胞数较转Kl基因小鼠(ICGN/KlTG)增多明显，并伴有抗凋亡蛋白Bcl-2的下调及凋亡蛋白Bax的上调。Yamamoto等[12]观察了Kl高表达转基因小鼠(EFmKL48)和野生型小鼠尿中8-OhdG(活体内DNA氧化损伤的生物标记)的分泌量发现，EFmKL48鼠尿中8-OhdG分泌量仅为野生型小鼠的一半，提示Kl的高表达能降低体内DNA的氧化损伤;在服用致死剂量的百草枯(除草剂，可产生过氧化物)后EFmKL48鼠的寿命长于野生型小鼠;在培养HeLa细胞的培养基中加入百草枯，处理组中加入可溶性的Kl蛋白，观察细胞脂质氧化。和对照组比较，处理组脂质过氧化情况较对照组明显减轻;在中国仓鼠卵巢细胞(CHO)细胞培养基中加入百草枯，处理组中加入可溶性Kl蛋白，发现和对照组相比处理组中细胞凋亡数目明显降低，以上实验均提示Kl具有抗氧化、抗应激、抗凋亡的作用，并认为其机理可能为Kl蛋白和细胞表面的Kl受体结合抑制特异性转录因子FOXO的磷酸化，加速了FOXO的核转位，细胞核的FOXO直接和超氧化物歧化酶2(SOD2)启动子相结合使SOD2表达增加，有利于对过氧化物的清除。但Ikushima等[13]发现Kl也可抑制由依托泊苷诱导的凋亡反应，依托泊苷是一种拓扑异构酶Ⅱ的抑制剂，其诱导的凋亡和氧化应激有一定的关系，说明Kl抑制凋亡可能还可通过另一条通路进行，即insulin/IGF- MnSOD通路，通路激活二氧化锰超氧化物歧化酶(MnSOD)的活性减轻氧化应激诱导的凋亡反应[12]。Ikushima等[13]用20 nM浓度的Klotho蛋白处理人脐静脉上皮细胞(HUVEC)后，和对照组比较，caspase3和caspase9的活性明显降低，但细胞活性升高明显，提示Kl还可能通过抑制caspase9-caspase3通路抑制凋亡反应。

　　3 Kl的抗衰老作用

　　Kl是哺乳动物体内第一个过表达延长生命、低表达加速衰老的衰老抑制基因。Kl的单核苷酸多态性和机体寿命、骨质疏松、脑血管事件、冠状动脉疾病有关，而且随着年龄的增长，血清Kl浓度呈下降趋势[6]，说明Kl基因参与到与机体寿命及衰老相关疾病的调节中。有资料表明其抗衰老作用与抗氧化作用紧密相关。Kurosu等[14]用两组无关的高表达Kl基因的转基因小鼠EFmKL46和EFmKL48，并和具有相同基因背景的野生型小鼠相比较发现EFmKL46和EFmKL48两组的寿命均明显长于野生型组。Ikushima等[13]用Klotho蛋白处理由H2O2诱导衰老的HUVEC后发现，和衰老相关的β半乳糖酐酶明显降低，同时处理组p53和p21的降低明显，提示Kl抗细胞衰老途径是通过抑制p53/p21途径完成的。Kurosu等[14]将Kl基因转入Kl完全缺失(Kl-/-)的衰老小鼠模型中干扰insulin/IGF-1信号通路，发现小鼠的衰老症状明显改善。目前认为Kl缺失引起衰老的原因主要有两点：1)Kl缺失时引起1,25(OH)2D3产生过多，引起体内钙、磷代谢紊乱[15];2)Kl缺失时氧化应激对insulin/IGF-1信号通路抑制作用增加[14]，抑制insulin/IGF-1信号转导通路是抑制衰老的高度进化保守机制，其机理可能为Kl抑制insulin/IGF-1受体络氨酸磷酸化，使胰岛素受体底物(insulin receptor substrate，IRS) 1、2和磷脂酰肌醇激3(PI3-kinase)活性降低，从而抑制insulin/IGF-1信号转导。

　　4 Kl的脏器保护作用

　　4.1 肾脏

　　Kuro-o等[1]等发现Kl在肾脏中高表达，但其确切的表达部位目前尚不明确。Koh等[16]发现Kl在远端小管周围表达。Mitobe等[9]通过组织学检查发现Kl在整个髓质集合管都有表达，同时在小鼠皮质集合管的M1细胞上也发现有Kl表达。Mitani等[17]通过原位杂交技术发现Kl mRNA主要在肾小管上皮细胞表达，以上结果可以肯定说明Kl主要在肾小管，并以集合管为主的部位表达。Sugiura等[18]发现双侧肾脏缺血再灌注的大鼠模型中，肾脏Kl基因和蛋白水平明显降低，在第10天后仍然低于假手术组，但逐渐可恢复到对照组水平;而之前用Kl转基因处理组血浆肌酐水平、组织损伤程度、凋亡细胞总数均较对照组程度为好，说明Kl表达的变化在肾脏缺血再灌注的病理生理过程中起着关键作用。Haruna等[11]研究发现给患有肾小球肾炎(ICGN)的小鼠动物模型转入Kl基因(ICGN/KlTG)后,和对照组比较其尿蛋白量、血肌酐水平改善明显;细胞增生、毛细血管袢增厚、系膜增厚、小管萎缩、间质硬化等形态学方面也改善明显，病死率明显降低，并认为Kl是通过减轻氧化应激对线粒体的损伤来实现肾脏保护功能的。既往研究表明，给大鼠持续微量泵入具有加压效应剂量的AgⅡ7天后可出现蛋白尿，肾小球滤过率下降[19]，但转入Kl基因后可使AgⅡ引起的尿蛋白分泌减少，虽然不能使肾小球滤过率改善，但可以防止它进一步恶化;同时还可以改善由AgⅡ引起的诸如小管上皮细胞塌陷、小管扩张、血管壁增厚和炎症细胞浸润等形态学损伤，但同时发现转入Kl后肾组织中Kl表达并无增多，而在肝脏、心脏和主动脉明显增多[17, 18]。提示Kl蛋白通过膜形式溶蛋白性裂解分泌，其代谢产物或下游的信号分子为一种激素因子。在慢性肾脏病患者中也发现肾脏Kl基因及蛋白表达均较对照组明显下降，可能与慢性肾脏病时肾单位减少和肾小管上皮细胞功能破坏有关[16]。以上实验说明在肾脏损害过程中伴有Kl表达的下降，而其表达下降不利于对肾脏功能的保护。

　　4.2 动脉

　　人类衰老过程与内皮细胞功能障碍密切相关，衰老是动脉粥样硬化危险因素之一，血管内皮细胞的凋亡和衰老是动脉粥样硬化发生的最初诱因，其发生与血管内皮组织再生能力低下和内皮细胞衰老有关，同时还和血管内皮细胞的更新及凋亡有关[20]。Kl基因缺陷小鼠在出生后4周即可出现动脉粥样硬化，并随增龄而加重，表现为主动脉严重钙化、肌性动脉中层钙化、内膜增厚，这些变化与人类动脉粥样硬化非常相似。把外源性Kl的cDNA转入Kl缺陷小鼠后其动脉硬化程度可得到显著改善[1]。Nakamura等[21]发现，和野生型Kl+/+大鼠相比，杂合子Kl-/+大鼠动脉环对乙酰胆碱的舒张功能明显减弱，尿中一氧化氮(Nitric oxide,NO)代谢产物明显减少，提示Kl-/+大鼠的内皮细胞NO产生减少、功能受损;同时发现Kl-/+大鼠血管内皮生长因子(VEGF)表达也较Kl+/+减少，VEGF可延缓血管内皮细胞衰老[22]。说明Kl的表达和血管内皮细胞NO及VEGF的合成减少密切相关，Kl可能通过对NO合成和VEGF表达的调节机制来防止血管内皮细胞功能衰老。Nakamura等[24]报道在Kl基因敲除小鼠血管内皮细胞NO的合成明显受损，对乙酰胆碱的血管舒张反应明显降低，认为Kl基因产物可能参与调节一氧化氮合酶(NOS)的功能，并有防止内皮细胞衰老的作用。Junsuke等[24]将含有Kl基因的质粒转入小鼠体内1周后发现小鼠血浆、肝脏、肾脏内的SOD活性明显增加，脂质过氧化物的含量明显减少，而且血浆中NO含量也增加，认为Kl对内皮细胞功能障碍的改善是通过调节体内氧化和抗氧化之间的平衡来完成的。

　　5 Kl对钙、磷代谢的调节作用

　　在敲除了Kl基因的小鼠身上还表现有明显的钙、磷代谢紊乱[25]。在1～2周龄的小鼠即可表现出高磷血症和高钙血症，其先于衰老表现出现，在3～4周龄或之后，钙、磷代谢紊乱更加明显。高钙血症导致血管和组织钙化，在主动脉表现为血管中层钙化，小血管主要为肾小血管受累[1]。尽管Kl缺乏小鼠表现为高钙血症和高磷血症，但血浆中1,25(OH)2D3升高[26]，而且在胫骨、股骨、椎骨表现为骨密度降低、骨皮质变薄 ，骨形态测定分析提示成骨细胞和破骨细胞的数量均减少[27]，但成骨细胞的减少多于破骨细胞的减少，导致骨质丢失。Kl对钙、磷的调节可能是通过纤维母细胞生长因子23(fibroblast growth factor-23，FGF23)来完成的。FGF23可抑制肾脏对磷的重吸收和维生素D的生物合成，血浆中FGF23水平升高后可造成磷的丢失和骨骼骨化功能障碍[28, 29]。有研究发现Kl-/-小鼠的表象和FGF23基因敲除的小鼠表象非常相似[15, 30]，提示FGF23和Kl有相同的信号传导通路。尽管FGF23可以和多种FGFs受体结合，但二者之间亲和力低，常需一些辅助因子如肝素或硫酸乙酰肝素[31]。现发现Kl和FGFs受体结合可明显增加FGF23和受体的亲和力[32, 33]，这可以解释为什么Kl-/-和FGF23缺失的小鼠具有相同的表象和为什么Kl缺失时体内FGF23水平升高明显[33]。FGF23可抑制编码1α-羟化酶的基因Cyp27b1表达，从而可抑制25(OH)D3向活性1,25(OH)2D3的转化;同时FGF23可增加编码24-羟化酶的基因Cyp24表达，该基因可抑制1,25(OH)2D3的活性，而1,25(OH)2D3可诱导FGF23的表达，这形成一个封闭的负反馈模式(图1)。甲状旁腺激素(PTH)在钙、磷代谢中也起着重要作用，PTH可以增加Cyp27b1基因的表达和血浆中1,25(OH)2D3的水平;同时因甲状旁腺也表达Kl，因此它也是FGF23作用的一个靶器官[34]，但不论在体内还是体外FGF23都明显抑制PTH的表达[35, 36]，此可进一步提高FGF23负调控维生素D的活性，并形成有骨骼、肾脏、甲状旁腺参与的环状负反馈调节模式(图1)。

　　6 其他

　　Kl在糖尿病中表达及其变化机理目前研究较少，Nobukazu 等[37]研究发现和对照组比较，注射链唑霉素(streptozotocin，STZ)的糖尿病大鼠造模成功4～8周后，肾脏组织中mRNA明显下降，而血红素加氧酶(heme oxygenase，OH-1)、铁蛋白表达增加，在不影响血压和血糖的情况下，血管紧张素受体Ⅰ拮抗剂(洛沙坦)和铁螯合剂(去铁敏)都可以抑制这种现象，提示糖尿病中血管紧张素受体Ⅰ的激活和氧化应激可能参与了对Kl的调节过程。在心脏中，Kl只在窦房结表达，Takeshita等[38]发现Kl缺失小鼠在束缚应激20小时后突发死亡率较对照组明显升高，并认为此和窦房结功能障碍有关。和野生型比较，Kl缺失小鼠在应激状态下心率和血浆中去甲肾上腺素都不能增高，提示Kl可能通过对去甲肾上腺素的调节参与应激状态下对窦房结的功能调节，但具体机制尚未明确。新近有研究表明，Kl缺乏小鼠红细胞胞浆中Ca2+浓度明显增加，而这可引起细胞皱缩和磷脂酰丝氨酸在膜上的分布导致细胞死亡[39]，此为临床对贫血的诊断及治疗提供了一个新的思路。

　　7 展望

　　Kl是哺乳动物体内第一个高表达延长生命、低表达加速衰老的衰老抑制基因。它同时具有配体、受体和酶的功能，有调节钙磷代谢、抗衰老、抗氧化、抗凋亡的作用并以此实现对脏器的保护。但Kl基因的许多问题还没有全面解决，如临床对多个早衰性冠状动脉疾病进行研究发现，其Kl基因的表达并无异常[40]。所以进一步对Kl蛋白的具体信号转导通路的过程(其中涉及信号转导体及这些信号与其他衰老途径的关系)进行研究，有望在实践中通过对Kl表达的调控对上述疾病提供一种新的治疗方法。

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