奥曲肽联合特异性COX.2抑制剂对肝癌细胞的抑制作用

　　作者：俞谦，孙为豪，刘顺英，欧希龙，曹大中，苏菡，江洁，俞婷(1.东南大学附属中大医院消化科，江苏南京 210009;2.南京医科大学第一附属医院老年医学科，江苏南京 210029)

　　Expression of substance P in intestinal tissue of rats and the relation between substance P and mucosa permeability in acute necrotizing pancreatitis

　　SU Shi-zhi，SHI Xin，GAO Nai-rong

　　(1.Department of General Surgery，Daxing Hospital，Bejing102600，China;

　　2.Department of General Surgery，Zhongda Hospital，Southeast University，Nanjing210009，China)

　　Abstract:Objective To investigate the expression of substance P in rats'intestinal tissue and study the relation be-tween substance P and mucosa permeability in acute necrotizing pancreatitis(ANP).Methods 80adult Sprague-Dawley rats were randomly divided into control group(n=40)and ANP group(n=40).Sacrifices were made in8，12，16and20h later in every group after ANP model was established by injecting5%sodium taurocholate into pancreatic duct respectively.The in-testinal mucosal permeability and the expression of substance P were studied.Results In ANP groups，intestinal mucosal per-meability and the expression of substance P were significantly higher than those in the control group(P<0.05).The overex-pression of substance P was correlated with the intestinal mucosal permeability in ANP(r=0.66，P<0.01).Conclusion The expression of substance P and the permeability in intestine of rats are increased significantly in ANP.There exists a possi-tive correlation between substance P and the intestinal permeability.

　　Key words:acute necrotizing pancreatitis;neurokinin-1receptor;substance P;intestinal mucosal permeability;rats

　　[摘要]目的: 研究特异性环氧化酶.2(COX.2)抑制剂NS.398和生长抑素类似物奥曲肽联合使用对人肝癌细胞系SMMC.7721增殖、凋亡的影响。 方法: 采用四氮唑盐比色法(MTT法)观察细胞增殖活力改变，流式细胞仪检测细胞凋亡百分率。 结果: (1)MTT法显示NS.398和奥曲肽均在一定范围内呈浓度和时间依赖性地抑制SMMC.7721细胞的增殖;联合用药组抑制率显著高于单用NS.398或奥曲肽组(P<0.01)，金正均方法显示q>1.15，提示两药联合应用有协同抑制肝癌细胞增殖效应，并随着作用时间延长而增强。(2)流式细胞仪测定显示，NS.398、奥曲肽和两药联合作用于SMMC.7721细胞24h后，联合用药组细胞凋亡率显著高于单一用药组(P<0.01)。 结论: NS.398和奥曲肽呈剂量、时间依赖性地抑制SMMC.7721细胞增殖，促进SMMC.7721细胞凋亡，两者联合应用具有协同作用。

　　[关键词] NS.398;奥曲肽;肝癌;细胞增殖;凋亡

　　对失去手术机会根治无望的原发性肝癌(primary hepatic carcinoma，PHC)目前尚缺乏有效的治疗手段。近年来国内外研究表明，非细胞毒性药物可抑制肿瘤的生长甚至转移，不良反应较轻。这类药物主要包括生长因子、激素、激素拮抗剂及环氧化酶.2(COX.2)抑制剂等[1～3] 。鉴于肝癌的发生和发展的多因素性和多环节性[4] ，联合用药方案成为大多数学者的选择。由于生长抑素类似物奥曲肽和特异性COX.2抑制剂的抗肿瘤机制不同，因此本研究通过肝癌细胞体外培养，采用四氮唑盐(MTT)比色法(MTT法)、流式细胞仪检测等方法，来观察奥曲肽联合特异性COX.2抑制剂NS.398对肝癌细胞生长有无协同抑制作用，为联合应用NS.398和奥曲肽治疗肝癌提供实验依据。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　1.1.1 细胞系来源

　　SMMC.7721人肝癌细胞系为东南大学遗传中心实验室所赠。

　　1.1.2 主要试剂

　　NS.398(美国Cayman公司)，奥曲肽(瑞士诺华公司)，RPMI Medium1640(美国Gibco公司)，HEPES、小牛血清、胰蛋白酶、MTT(Amresco公司)，AnnexinⅤ.FITC试剂盒(Gender公司)。

　　1.2 实验方法

　　1.2.1 细胞培养

　　肝癌SMMC.7721细胞常规培养于含有10%小牛血清、100U?ml-1 青霉素、100U?ml-1 链霉素的RPMI1640培养液中，吹打细胞使之悬浮并接种到培养瓶中，37℃、CO2 体积分数为0.05、饱和湿度条件下培养。每2～3d用0.25%胰蛋白酶消化传代。

　　1.2.2 MTT法

　　实验先设空白组[仅含培养液和等体积的二甲亚砜(DMSO)]、对照组(SMMC.7721细胞的单细胞悬液200μl加等体积的DMSO)及实验组(SMMC.7721细胞的单细胞悬液200μl加药物100μl)。实验组又分为NS.398、奥曲肽的不同浓度梯度组，其中NS.398为5个浓度梯度(1×10 -8 ～1×10-4 mol?L-1 )，奥曲肽也为5个浓度梯度(1×10-9 ～1×10-5 mol?L-1 )，每组设4个复孔。取对数生长期的SMMC.7721细胞制成单细胞悬液，调整细胞浓度为5×104 ml-1 ，接种于96孔培养板内(200μl?孔-1 )培养24h，加入不同浓度的药物100μl，分别培养12、24、48及72h，然后每孔加入MTT液20μl(5mg?ml-1 )，继续培养4h，吸去上清液，每孔加入DMSO150μl终止反应，将96孔板移入平板震荡器，水平震荡10min，使MTT还原产物完全溶解，用DG.3022A型酶联免疫检测仪于570nm波长处 测定每孔吸光度(A)值，结果以每组4个孔的ˉx±s表示，实验重复3次。由以上实验得出奥曲肽在1×10-6 mol?L-1 作用72h抑制率为42.4%，NS.398于1×10-5 mol?L-1 作用72h抑制率为44.6%，都接近半数抑制量，故以下实验选择1×10-6 mol?L-1 奥曲肽联合1×10-5 mol?L

　　-1 NS.398作用于SMMC.7721细胞72h，初步观察两药的相互作用。

　　1.2.3 流式细胞仪检测细胞凋亡情况

　　收集NS.398、奥曲肽单用及联合应用24h后的SMMC.7721细胞1.0×106 ml-1 ，PBS洗涤后用消化液消化成单细胞悬液，取1ml细胞，1000r?min-1 、4℃离心10min，弃上清，加入1ml冷的PBS，轻轻震荡使细胞悬浮，1000r?min-1 、4℃离心10min，弃上清，重复用冷的PBS洗两次，将细胞重悬于200μl Binding Buffer，加入10μl An-nexin V.FITC和5μl碘化丙啶轻轻混匀，避光室温反应15min或4℃反应30min，加入300μl Binding Buffer，在1h内上机检测细胞的凋亡率。

　　1.3 药物相互作用结果判断

　　用金正均方法[5] ，在量效曲线线性区内，两药合并用药的抑制率及两个单用药的抑制率用如下公式计算q值:q=两药合用的抑制率.两单药预计抑制率=EA+B .EA +(1-EA )×EB 。当q=1.00±0.15时，两药有相加作用;q>1.15时，两药有协同作用;当q<0.85时，两药有拮抗作用。

　　1.4 统计学处理

　　MTT法和流式细胞仪测定数据采用统计软件SPSS11.5统计处理，显著性检验采用单因素方差分析，P<0.05表示差异有显著性。

　　2 结 果

　　2.1 MTT法比色结果

　　NS.398、奥曲肽不同浓度、不同时间对细胞的抑制率按下列公式计算:肿瘤细胞的生长抑制率(%)=(1-实验组A值.对照组A值)×100%，结果见表1、2、3。表1 奥曲肽作用于SMMC.7721细胞的吸光度与抑制率 时间.h A值(略)表2 NS.398作用于SMMC.7721细胞的吸光度与抑制率 时间.h A值(略)表3 奥曲肽联合NS.398作用于SMMC.7721细胞的吸光度与抑制率 时间.h A值(略)

　　结果表明，1×10-6 mol?L-1 奥曲肽联合1×10-5 mol?L-1 NS.398作用于SMMC.7721细胞24、48、72h后，吸光度与对照组相比有显著性差异(P<0.01)，与两药单用相比也有显著性差异(P<0.01);联合用药组的抑制率与两药单用相比有显著性差异(P<0.01)，药物相互作用q24h =1.20，q48h =1.24，q72h =1.28，初步提示两药联用对细胞增殖有协同抑制作用，且协同作用随时间的延长而增强。

　　2.2 细胞凋亡情况检测结果 见表4。表4 奥曲肽、NS.398单独及联合作用24h SMMC.7721细胞的凋亡率(略)

　　结果表明，1×10-6 mol?L-1 奥曲肽、1×10-5 mol?L-1 NS.398单独及联合作用于SMMC.7721细胞24h后，细胞凋亡率与对照组相比有显著性差异(P<0.01)，联合用药组与各单独用药组相比也有显著性差异(P<0.01)，提示两药联合应用能显著提高肝癌细胞的凋亡率。

　　3 讨 论

　　本研究结果显示:(1)特异性COX.2抑制剂NS.398、生长抑素类似物奥曲肽可以抑制肝癌SMMC.7721细胞的生长，在一定范围内呈浓度和时间依赖性;联合应用NS.398、奥曲肽对SMMC.7721细胞的增殖呈协同抑制作用，并随时间的延长抑制作用也增强。(2)NS.398、奥曲肽可以诱导SMMC.7721细胞的凋亡，两者联合应用可显著提高肝癌细胞的凋亡率。

　　最近的研究表明，生长抑素类似物奥曲肽与其特异性受体(SSTR)结合后经过4个重要信息传导途径发挥直接的抗肿瘤作用:(1)环磷酸腺苷(cAMP)途径。一般认为胞内cAMP升高会诱发肿瘤增殖活动，而奥曲肽结合后的SSTR能与腺苷环化酶负性结合，降低胞内cAMP浓度，从而抑制肿瘤增殖。(2)有丝分裂原激活蛋白激酶(MAPK)途径。奥曲肽可通过SSTR的介导激活酪氨酸磷酸化酶(PTP)，从而调控MAPK活性，影响癌基因c-fos、c-myc、c-jun的转录，抑制DNA蛋白质的合成，使肿瘤细胞进入静止期而停止增殖。(3)钙离子(Ca2+ )途径。奥曲肽结合后的SSTR2、SSTR5可通过抑制细胞外Ca2+ 内流降低细胞内Ca

　　2+ 浓度，从而发挥抗肿瘤细胞增殖作用。(4)磷酸酪氨酸磷酸酶(pt-pase)的激活。膜蛋白上酪氨酸残基的磷酸化与信息传导通路有关。酪氨酸激酶的活化刺激细胞生长及过度表达、持续激活，导致细胞转化，而ptpase则能抑制这种作用。因此认为奥曲肽通过SSTR激活ptpase，干扰细胞周期，发挥抗有丝分裂作用。

　　奥曲肽还可通过减少某些生长因子、激素的分泌和肿瘤的血供，调节机体免疫活性和促进细胞凋亡等方式而发挥间接抗肿瘤作用。

　　大量研究表明，COX.2的过度表达与消化道肿瘤的发生、发展密切相关。COX.2促进肿瘤发生发展的作用主要通过其催化产生的前列腺素E2 (PGE2 )而发 挥。PGE2 是一种免疫调节抑制因子，高浓度的PGE2 可抑制抗肿瘤抗体的产生及巨噬细胞、T杀伤细胞的活性，抑制TNF.α、IFN.α等淋巴因子的产生而有利于肿瘤的生成。PGE2 还可刺激成纤维细胞的有丝分裂而诱导肿瘤血管形成，并诱导bcl.2、H-ras、K-ras等促癌基因的表达而抑制凋亡、促进增殖[6] 。动物实验已经证实，COX-2基因表达及其产物PGE2 能够促进凋亡抑制基因bcl-2的表达并引起细胞凋亡减少[7，8] 。过度表达COX.2已证实能导致转基因鼠发生肿瘤。而一般认为COX.2抑制剂主要通过抑制COX.2、减少PGE2 的生成和抑制MAPK的活性，使肿瘤增殖受到抑制。而有研究显示，选择性COX.2抑制剂抑制肝癌细胞的作用随着COX.2抑制剂选择性的增高而增强[9] 。

　　由此可见，生长抑素、COX.2抑制剂均能通过抑制肿瘤细胞增殖、促进肿瘤细胞凋亡而在肝癌的治疗中起重要作用。奥曲肽和NS.398抑制肿瘤生长的机制不尽相同，但在哪些环节上产生协同作用尚不清楚。有研究表明，奥曲肽能抑制转录激活蛋白.1(activator protein.1，AP.1)的活化[10] ，而COX.2启动子上有AP.1结合位点[11] ，当两者联合应用时，可能加强抑制AP.1DNA结合活性，使肿瘤基因、COX.2及其他生长因子的转录下调至很低水平甚至停止，从而产生显著的抑制肿瘤生长、促进肿瘤坏死的作用。Hussin等

　　[12] 的研究均发现非甾体抗炎药也能抑制MAPK活性，MAPK信号途径可能是两者协同作用的重要途径之一。

　　本研究以人肝癌细胞株SMMC.7721作为研究对象，利用MTT法探索奥曲肽、NS.398对SMMC.7721细胞的增殖抑制作用，MTT法测定原理是活细胞线粒体内脱氢酶可将MTT裂解为蓝紫色的甲 月 赞 结晶，甲 月 赞 产量与活细胞数成正比。该方法误差小，目前广泛用于活细胞检测及药物敏感性检测。结果证实:NS.398、生长抑素对肝癌SMMC.7721细胞的增殖均有明显抑制作用，其抑制作用在一定范围内呈浓度、时间依赖性增高。一定浓度下两药联合应用对肝癌细胞的增殖呈协同抑制作用，并随作用时间的延长而增强。

　　流式细胞仪测定细胞凋亡的物质基础为核酸内切酶激活、DNA广泛断裂。由于细胞通透性增加和固定剂的影响，降解的DNA碎片在洗染过程中从细胞内逸出，因此凋亡细胞的DNA含量减少;凋亡的细胞由于发生DNA降解，与荧光染料的结合减少，故细胞的荧光强度降低。本实验结果显示，1×10-5 mol?L-1 NS.398、1×10-6 mol?L-1 奥曲肽单独及联合作用于SMMC.7721细胞后，3组的细胞凋亡率分别为(14.85±0.60)%、(6.12±0.68)%及(19.83±1.90)%，与正常对照组比较均显著增高，且联合用药组细胞凋亡率显著高于单独用药组，说明NS.398联合奥曲肽较两者单独应用更能促进肝癌细胞的凋亡。两药联用时，奥曲肽还可作用于胃黏膜壁细胞上的生长抑素受体，降低胃酸分泌，可进一步减少COX.2抑制剂的胃肠道副作用。奥曲肽联合NS.398对肝癌细胞生长的高效抑制作用及低副作用，使其有望成为PHC的一个治疗方法。

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