慢性乙型肝炎患者血清抗HP抗体检测及其与年龄变化、病毒载量和病毒基因型的关系分析

　　作者：张永贵 王江滨 季尚玮 作者单位：吉林大学中日联谊医院消化内科，吉林 长春 130033

　　【摘要】 目的 探讨幽门螺杆菌(HP)在慢性乙型肝炎中的作用。方法 采用病例对照研究的方法分析376例慢性乙型病毒性肝炎患者的HP感染状况与年龄、乙型肝炎病毒(HBV) DNA定量和分型的关系。结果 HP感染率随年龄变化无明显差异(P>0.05)，HP感染率在慢性乙型肝炎组(56.2%)、乙型肝炎肝硬化组(69.9%)、乙型肝炎合并肝癌组(75.0%)明显高于健康对照组(43.4%)(P<0.01)，各组与慢性胃炎组(57.9%)相比较无明显差异(P>0.05)，其中肝硬化组和合并肝癌组HP感染率均高于肝炎组(P<0.05)。不同病毒载量慢性乙型肝炎患者的HP感染率均明显高于健康对照组(P<0.01)，但不同病毒载量之间无明显差异(P>0.05)。慢性乙型肝炎患者B基因型、C基因型和D基因型HP感染率分别为61.3%、63.3%和50.0%，三组之间比较无统计学意义(P>0.05)。结论 慢性乙型肝炎患者HP感染率明显增加，且HP感染率随着肝病病变程度的进展而增加。

　　【关键词】 幽门螺杆菌;慢性乙型肝炎;HBV DNA

　　基金项目：国家自然科学基金资助项目(30670300)

　　Relationship analysis between anti-HP-IgG seroprevalence with aging，HBV load and HBV genotypes in patients with chronic hepatitis B

　　ZHANG Yong-Gui, WANG Jiang-Bin, JI Shang-Wei.

　　Gastroenterology and Hepatology Department, China-Japan Union Hospital of Jilin University, Changchun 130033, Jilin, China

　　【Abstract】 Objective To explore the role of HP in chronic hepatitis B. Methods The seroprevalence of HP infection and the quantity and genotyping of HBV DNA in 376 cases of chronic hepatitis B were detected in this case-control study.Results HP seropositivity rate had no significant difference in patients with different age (P>0.05). HP seropositivity rate in patients with chronic hepatitis B (56.2%), chronic cirrhosis of HBV (69.9%) and HBV-related hepatocellular carcinoma (HCC) (75.0%) were significantly higher than that in normal controls (43.4%) (P<0.01), had no difference compared with that of chronic gastritis (57.9%) (P>0.05), of the total, that of chronic cirrhosis and hepatocellular carcinoma were higher than that of chronic hepatitis (P<0.05). With the different quantity of HBV, HP seropositivity rate all increased compared with that of normal controls (P<0.01); but there was no significant difference between the different quantity of virus (P>0.05). HP seropositivity rate in chronic hepatitis patients with genotype B，C and D was 61.3%, 63.3% and 50.0% respectively, but having no significant difference (P>0.05). Conclusions Seroprevalence of antibodies to HP is found to be higher in patients with chronic hepatitis B，and HP seropositivity rate increases with pathological changes of chronic hepatitis B.

　　【Key words】 Helicobacter pylori; Chronic hepatitis B; HBV DNA

　　在慢性乙型肝炎的病理进程中，乙型肝炎病毒(HBV)的致病性起着重要作用〔1〕，但近年来人们又发现同为乙型肝炎患者，在除外饮酒、药物、自身免疫、遗传易感等因素外，患者之间的临床表现及疾病转归却存在巨大差异，因此，人们一直在寻找并研究与嗜肝病毒在慢性肝损伤及癌变发生过程中具有协同作用的其他感染因素。1992年Fox等在A/J Cr小鼠的胆囊和胆小管中发现螺杆菌样细菌〔2〕。进一步的研究表明该螺杆菌可引起某些品系的小鼠发生慢性活动性肝炎,并能导致敏感小鼠的肝癌。该发现使人们将嗜肝细菌与肝癌的发生联系起来。某些肝癌的发生发展是否与螺杆菌感染有关? 螺杆菌与肝炎病毒在肝损伤的发生过程中是否具有协同致病作用?已成为近年来人们开始关注的问题，而且已有研究者在慢性病毒性肝炎患者的肝脏组织中发现幽门螺杆菌(HP)及其他螺杆菌属DNA的存在〔3～5〕，提示螺杆菌属感染可能在慢性病毒性肝病的发生发展过程中发挥重要作用。而在国内相关研究较少，本课题通过对376例不同年龄慢性乙型肝炎患者HP感染状况调查，探讨了HP感染与慢性乙型肝炎之间的关系，分析了HP在慢性乙型肝炎中的致病作用。

　　1 资料与方法

　　1.1 一般资料

　　病例组为吉林大学中日联谊医院2006年1～12月期间门诊及住院的HBV DNA定量检测阳性的慢性乙型肝炎患者376例(男216例，女160例，年龄23～85岁)，诊断标准符合2000年第十次全国病毒性肝炎及肝病学术会议修订的《病毒性肝炎防治方案》的标准，也符合2006年中华医学会传染病与寄生虫病学分会、肝病学分会《乙型肝炎防治指南》中有关标准，其中慢性乙型肝炎267例，慢性乙型肝炎肝硬化73例，慢性乙型肝炎合并肝癌36例。除外合并其他肝病因素如自身免疫性疾病、代谢性疾病、饮酒、药物等，且各组病例一个月内均未接受过抗生素治疗。健康对照组为同期健康献血者327例(男210例，女117例，年龄25～50岁)。慢性胃炎组为同期经胃镜诊断为慢性胃炎患者328例(男175例，女153例，年龄21～83岁)。

　　1.2 实验方法

　　1.2.1 HP感染的检测及判定

　　采用HP流行病学诊断标准中的血清学试验诊断法，即应用酶联免疫吸附测定法(试剂盒由华美生物工程公司提供)检测被检者血清中anti-HP-IgG判定是否存在HP感染。

　　1.2.2 HBV DNA定量检测

　　采用实时荧光定量聚合酶链反应方法检测血清中HBV DNA的含量。上游引物：5′-CCTCCTCATCCTGCTGCT-3′;下游引物：5′-AACTGAAAGCCAAACAGTG-3′。探针序列：5′-TET-TCCCATCCCATCATCCCTGGGCTTT-TAMRA-3′。PCR反应条件：预变性93℃ 2 min，93℃ 45 s， 55℃ 1 min 10个循环，93℃ 30 s， 55℃45 s 30个循环。最低检测下限为1.0×103 拷贝/ml。检测试剂盒由广州中山大学达安基因股份有限公司提供。

　　1.2.3 HBV DNA分型

　　采用聚合酶链反应-微板核酸杂交-酶联免疫测定法。以HBV DNA核心区保守序列作为引物，通过聚合酶链反应扩增患者的血清标本，再与型特异性探针夹心杂交，最后通过酶联显色检测HBV DNA分型。引物序列：上游引物：5′-CTCGTGGTGGACTTCTCTC-3′;下游引物：5′-CTGCAGGATGAAGAGGAA-3′。PCR反应条件：预变性94℃ 2 min，94℃ 35 s， 55℃ 40 s， 72℃ 55 s 38个循环，72℃延伸3 min。试剂由广州第一军医大学蓝星生物科技开发有限公司提供。

　　1.3 统计学方法

　　样本均数的比较采用t检验，率的比较采用χ2检验。

　　2 结 果

　　2.1 慢性乙型肝炎患者HP感染率的调查

　　慢性乙型肝炎患者HP感染率为60.6%，明显高于健康对照组(43.4%)(P<0.01);接近于慢性胃炎组的57.9%。为进一步分析不同程度病变与HP感染的相关性，对376例的慢性乙型肝炎病人根据疾病程度分为肝炎、肝硬化和合并肝癌组，HP感染率调查结果显示慢性乙型肝炎组HP感染率为56.2%，乙型肝炎肝硬化组和合并肝癌组的感染更高，分别为69.9%和75.0%，高于慢性乙型肝炎组(P<0.05)。见表1。表1 慢性乙型肝炎患者HP感染率的调查(略)

　　同时再将376例慢性乙型肝炎患者分为30岁以下、30～39岁、40～49岁、50～59岁及60岁以上5个亚组，分析不同年龄组中的HP感染情况，结果显示不同年龄分组之间的HP感染率无明显差异(P>0.05)。见表2。表2 不同年龄组慢性乙型肝炎患者HP感染率的调查(略)

　　2.2 慢性乙型肝炎患者血清病毒载量与HP感染的关系分析

　　将慢性乙型肝炎患者按照HBV DNA载量进行分组，比较各组之间HP感染状况，慢性乙型肝炎患者HP感染率均明显高于健康对照者(P<0.01)，但不同病毒载量之间无明显差异(P>0.05)，见表3。表3 慢性乙型肝炎患者血清病毒载量与HP感染的关系分析(略)

　　2.3 不同基因型慢性乙型肝炎患者HP感染率分析

　　对98例慢性乙型肝炎患者HBV DNA基因型与HP感染率的关系进行分析，结果显示，本组病例中以C基因型患者为主，占61.2%，HP感染率63.3%(38/60);B基因型次之，占31.6%，HP感染率61.3%(19/31);而D、A基因型较少，仅分别占6.1%及1%，HP感染率分别为50.0%(3/6)和0(0/1)。C基因型、B基因型和D基因型三组之间HP感染率比较无统计学意义(P>0.05);A基因型患者例数太少，未进行统计。

　　3 讨 论

　　近年来，HP与肝脏疾病的关系已被许多学者广泛关注。Fan等〔6〕报道慢性乙肝患者的HP感染率显著高于一般人群,且感染HP的乙肝患者HBV DNA复制水平明显增高。研究显示乙肝肝硬化和原发性肝癌病人的HP感染率明显高于对照组〔7,8〕。Avenaud等在8例肝癌标本中发现了螺杆菌16S rDNA 存在，测序证明与HP具有99%同源性〔4〕。

　　本研究结果表明慢性乙型肝炎组、乙型肝炎肝硬化组及乙型肝炎合并肝癌组HP感染率均明显高于健康对照组，其中肝硬化组和合并肝癌组HP感染率均高于肝炎组(P<0.05)，提示慢性乙型肝炎患者HP感染率明显增加，且随着病变程度的进展，HP感染率亦明显增加，与Fan、Antonio和Nicola等人的多项研究结果基本相一致，提示HP在慢性乙型肝炎(尤其是肝硬化和肝癌)的发生发展中可能与HBV发挥协同致病作用;但不同年龄分组之间的HP感染率无明显差异。同时我们还发现不同病毒载量的慢性乙型肝炎患者的HP感染率均明显高于健康对照者，而不同病毒载量之间无明显差异，提示HP感染率与病毒载量之间缺乏相关性。

　　另外，有研究表明宿主因素在慢性乙型肝炎的进展中发挥作用，如Watanabe等认为乙肝患者C基因型较B基因型易发生基本核心启动子(BCP)区A1762T、G1764A双突变，并且由于双突变引起3′-茎袢结构变化导致其稳定性提高，促进了HBV逆转录的发生，使病毒复制增强，导致疾病进展〔9〕。Lindh等研究认为乙肝患者C基因型与肝硬化及原发性肝细胞癌的发生呈正相关，B基因型慢性乙肝患者进展为肝纤维化和原发性肝细胞癌的时间晚，预后较C基因型患者好〔10〕。我们按照HBV DNA基因分型对本地区慢性乙型肝炎患者进行分组后比较各组之间HP感染状况，结果表明：乙肝组C基因型患者HP感染率最高，其次为B及D基因型患者，但C基因型、B基因型和D基因型三组之间HP感染率比较无统计学意义(P>0.05);A基因型患者例数太少，未进行统计。综上所述，现有调查研究显示尚未发现HP感染与HBV DNA基因分型之间存在相关性。目前国内外尚无相关方面的研究报道可供参考。

　　关于HP感染与HBV在慢性乙型肝炎发生发展中的协同致病作用机制尚不清楚，可能与炎症介质和细胞免疫的参与因素有关。有报道表明在HP感染的保护性免疫中发挥重要免疫调节作用的是CD+4T辅助细胞(Th)。HP感染均导致Th1型免疫应答，Th1细胞分泌白细胞介素-2(IL-2)、γ-干扰素(INF-γ)、白细胞介素-12(IL-12)等细胞因子，并通过活化巨噬细胞和杀伤性T细胞而消灭病原体，但在抗感染的同时也会因为Th1细胞分泌的细胞因子激活大量免疫/炎性细胞聚集造成炎症性组织损伤〔11〕。Baldari等最近研究数据也证实HP感染能促进单核细胞的衍生并伴随着IL-2的高水平表达，有助于Th1细胞的应答〔12〕。Yamaok等研究发现HP感染后诱导了一系列的细胞因子高水平表达，这些细胞因子构成了一个复杂炎症调节网络。肝炎病毒感染后，可使机体免疫系统活化，释放白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-8(IL-8)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)等多种细胞因子，体内的IL-6、IL-8、TNF-α高水平表达与病毒的复制、内毒素血症及免疫功能失调有关，这些细胞因子可能促使肝内炎症反应，介导肝细胞损伤，诱导各类细胞分化增殖，从而使慢性肝脏炎症持续存在〔13〕。HP等螺杆菌属是白细胞介素-1(IL-1)、白细胞介素-6(IL-6)、TNF-α和细胞间黏附分子-1(ICAM-1)的强烈诱导剂，是炎症反应的强烈激活因子。这些细胞因子能促进淋巴细胞在肝脏的局部聚集并增加肝细胞毒性〔14〕。因此，螺杆菌感染能导致感染部位大量淋巴细胞和多形核细胞的聚集，继而参与体内肝脏炎症损伤。

　　综上所述，我们仅对HP感染与HBV在慢性乙型肝炎发生发展中可能的协同作用做了流行病学方面的调查研究，但二者之间的协同致病机制尚不明确，可能的协同致病作用考虑如下：HP感染与HBV感染均是慢性持续性感染过程，他们在局部的感染可能引起全身的系统性反应;持续性感染可诱发慢性炎症反应和免疫应答反应，导致感染局部位置和其他部位的损伤〔15〕。但上述观点仅为探讨HP感染与慢性乙型肝炎相关性的可能发病机制，而具体发病机制如HP感染对肝细胞的炎症、坏死、凋亡、肝纤维化、肝癌的发生机制以及是否伴有其他螺杆菌的感染还需要从多方面进一步探讨和研究。

　　【参考文献】

　　1 Huang YH，Wu GH.Relationship between hepatitis B and liver cancer〔J〕.Shijie Huaren Xiaohua Zazhi，2001;9：682-5.

　　2 Fox JG，Dewhirst FE，Tully JG，et al.Helicobacter hepaticus sp.nov,a microaerophilic bacterium isolated from livers and intestinal mucosal scrapings from mice〔J〕.J Clin Microbiol，1994;32(5)：1238-45.

　　3 Fox JG，Dewhirst FE，Shen ZL,et al.Hepatic Helicobacter species identified in bile and gallbladder tissue from Chileans with chronic chlecystitis〔J〕.Gastroenterology，1998;114(4)：755-63.

　　4 Avenaud P，Marais A，Monteiro L,et al.Detection of Helicobacter species in the liver of patients with and without primary liver carcinoma〔J〕. Cancer，2000;89(7)：1431-9.

　　5 Nilsson HO，Taneera J，Castedal M,et al.Identification of Helicobacter pylori and other Helicobacter species by PCR，hybridization，and partial DNA sequencing in human liver samples from patients with primary sclerosing cholangitis or primary biliary cirrhosis〔J〕.J Clin Microbiol,2000;38(3)：1072-6.

　　6 Fan XG，Zou YY，Wu AH,et al.Seroprevalence of Helicobacter pylori infected in patients with hepatitis B〔J〕.Br J Biomed Sci，1998;55(3)：176-8.

　　7 Ponzetto A，Pellicano R，Leone N,et al.Helicobacter pylori seroprevalence in cirrhotic patients with hepatitis B virus infection〔J〕.Neth J Med，2000;56(6)：206-10.

　　8 Leone N，Pellicano R，Brunello F,et al.Helicobacter pylori seroprevalence in patients with cirrhosis of the liver and hepatocellular carcinoma〔J〕.Carcer Detect Prev，2003;27(6)：494-7.

　　9 Watanabe K，Takahashi T，Takahashi S,et al.Comparative study of genotype B and C hepatitis B virus-induced chronic hepatitis in relation to the basic core promoter and precore mutation〔J〕.J Gastroenterol Hepatol，2005;20(3)：441-9.

　　10 Lindh M，Hannoun C，Dhillon AP,et al.Core promoter mutation and genotypes in relation to viral replication and liver damage in East Asian hepatitis B virus carriers〔J〕.J Infect Dis，1999;179(4)：775-82.

　　11 Pappo J，Torrey D，Gastriotta L,et al.Helicobacter pylori infection in immunized mice lacking major histocompatibility complex class Ⅰ and class Ⅱ functions〔J〕.Infect Immun，1999;67(1)：337-41.

　　12 Baldari CT，Lanzavecchia A，Telford JL.Immune subversion by Helicobacter pylori〔J〕.Trends Immunol，2005;26(4)：199-207.

　　13 Yamaoka Y，Kita M，Kodema T,et al.Helicobacter pylori cagA gene and expression of cytokine messenger RNA in gastric mucosa〔J〕. Gastroenterology，1996;110(6):1744-52.

　　14 Penzetto A，Pellicano R，Leone N,et al.Helicobacter infection and cirrhosis in hepatitis C virus carriage：is it an innocent bystander or a troublemaker?〔J〕.Med Hypotheses，2000;54(2)：275-7.

　　15 Dore MP，Realdi G，Mura D,et al.Helicobacter infection in patients with HCV-related chronic hepatitis，cirrhosis，and hepatocellular carcinoma〔J〕.Dig Dis Sci，2002;47(7)：1638-43.