STAT3及相关生长调控基因在胃癌组织中的表达及意义

　　作者：李静 朴云峰 安鼎伟 金丽君 陈丽 作者单位：吉林大学第一医院消化科，吉林 长春 130021

　　【摘要】 目的 探讨转录信号传导子与激活子3(STAT3)及相关生长调控基因在胃癌发生发展中的作用及意义。方法 应用RT-PCR检测STAT3基因及相关基因c-myc，p53，生存素(survivin)，血管内皮生长因子(VEGF)的mRNA表达水平，应用Western印迹法及免疫组化法检测STAT3基因的蛋白水平及定位表达。结果 胃癌组织及癌旁组织中STAT3 mRNA的表达均明显高于正常胃组织(P<0.01)，胃癌及癌旁组织中c-myc，survivin，VEGF mRNA的表达上调(P<0.01)，p53 mRNA的表达下调(P<0.01)，胃癌组织及癌旁组织中STAT3蛋白水平的表达均高于正常胃组织(P<0.01)。结论 STAT3基因的持续激活在胃癌的发生发展中起重要作用，可作为早期诊断的指标及治疗的靶点。

　　【关键词】 STAT3;胃癌;基因

　　转录信号传导子与激活子3(STAT3)是STAT家族的重要成员，其所参与的信号传导通路与细胞的增殖、分化及凋亡密切相关，该通路持续激活可导致细胞异常增殖和恶性转化〔1〕。已有研究证实STAT3的酪氨酸磷酸化，即信号依赖的活化形式，在多种肿瘤中普遍存在，并在某些肿瘤中发挥重要作用〔2〕。目前有关STAT3的研究主要集中于白血病、多发骨髓瘤、乳腺癌、前列腺癌、黑色素瘤、肺癌等，国内外关于STAT3在消化系统疾病中的研究尚不多见，国内的研究〔3，4〕多侧重STAT3在胃癌组织中和胃癌细胞中的阳性表达及临床意义等，国外的研究〔5，6〕多侧重于各种细胞因子包括白细胞介素-6(IL-6)、DIF、VEGF等对JAK/STAT信号通路中STAT3活性的影响。本研究拟通过检测STAT3基因在人胃癌组织中基因及蛋白水平的表达，同时检测相关生长调控基因c-myc，p53，生存素(survivin)，血管内皮生长因子(VEGF) mRNA水平的表达，探讨STAT3基因异常在胃癌发生发展中的作用及可能的机制。

　　1 材料与方法

　　1.1 病例资料 15例均为住院病人(吉林大学第一医院2005年9月～2006年12月)，经胃镜及黏膜活检病理定诊，均行胃癌切除术，术后病理证实为胃癌。男10例，女5例，年龄60～74(平均65)岁。

　　1.2 标本来源 新鲜胃癌术后组织包括正常胃组织、癌旁组织、胃癌组织，部分液氮保存，待提取RNA及蛋白，部分福尔马林固定，石蜡包埋，待免疫组化染色。

　　1.3 主要试剂及仪器 Anti-P-STAT3兔抗人多克隆抗体、辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗购自Santa Cruz公司，Anti-STAT3及SABC组化试剂盒购自武汉博士德公司。Trizol购于北京鼎国公司，RT-ACE购于Invitrogen公司，Taq DNA聚合酶购于Genomy公司，常规试剂由吉林大学前列腺疾病防治研究中心提供。PCR仪(SONY,Japan),电泳仪(Bio-Rad,USA)，蛋白质电泳转膜仪(Bio-Rad,USA)。

　　1.4 实验方法

　　1.4.1 免疫组化法 按说明书操作。阳性结果为细胞浆或胞核棕黄着色，随机选取5个高倍镜视野，计数阳性细胞占所研究细胞的15%以上即为阳性。

　　1.4.2 RT-PCR法 液氮保存组织常规提取RNA，紫外分光光度计法定量后取10 μg总RNA逆转录为cDNA，PCR条件：94℃ 5 min;94℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃ 45 s，30个循环;72℃ 7 min,同时检测c-myc、p53、survivin、VEGF，以β-肌动蛋白(β-actin)为内参。PCR产物以2%琼脂糖凝胶电泳，EB染色，应用天能Gis凝胶成像系统分析，PCR产物量以光密度/面积表示，以STAT3产物量/β-actin产物量的比值为最终结果，实验重复三次。引物序列：STAT3：正义引物5′TTGCCAGTTGTGGTGATC 3′，反义引物5′AGACCCAGAAGGAGCCGC 3′;β-actin：正义引物5′AAGTACTCCGTGTGGATCGG 3′ ,反义引物5′ATGCTATCACCTCCCCTGTG 3′;c-myc：正义引物5′CTGCTGCCAAGAGGGTCA 3′，反义引物5′CGTTTCCGCAACAAGTCC 3′;VEGF：正义引物5′ AAAGGAGCCTACAAGA 3′，反义引物5′ TTCACAAGCAGCCAAT 3′;p53：正义引物5′CCTCCTCAGCATCTTATCCG 3′，反义引物5′ CACAAACACGCACCTCAAA 3′;survivin:正义引物5′GAATTCATGGGTGCCCCGACCTTGCC 3′，反义引物5′AGATCTTTCTTCTTATTGTTGGTTTCC 3′,引物均由上海生工公司合成。

　　1.4.3 Western印迹法 液氮保存组织常规提取蛋白，应用Bio-Rad标准曲线蛋白定量，40 μg总蛋白加入等体积的2×上样缓冲夜混匀后煮沸变性5 min，蛋白分离电泳采用12%十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶，电泳后采用半干法转膜至PVDF膜，Anti-P-STAT3兔抗人多克隆抗体浓度1∶200，辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗浓度1∶2 000，显色应用DAB。应用天能Gis凝胶成像系统分析，蛋白量以光密度/面积表示，以STAT3蛋白量/β-actin蛋白量的比值为最终结果,实验重复三次。

　　1.5 统计学方法 应用SPSS12.0软件行相关数据分析，计量资料采用x±s表示;两组均数的比较用t检验。

　　2 结果

　　2.1 STAT3基因及相关生长调控基因的mRNA表达水平 胃癌、癌旁、正常组织中均有STAT3基因表达，PCR产物量STAT3/β-actin的比值(%)分别为72.66±2.02，71.20±2.60，32.60±2.30，胃癌、癌旁组织中的表达显著高于正常组织(均P<0.01)。同时检测的c-myc，survivin，VEGF基因在胃癌、癌旁、正常组织的PCR产物量/β-actin的比值分别为91.47±0.75，91.32±1.16，52.67±2.67;86.54±0.36，71.73±2.16，11.76±2.08;90.50±0.82，88.77±0.93，48.25±1.27，胃癌、癌旁组织中的表达均显著高于正常组织(均P<0.01)，p53基因在胃癌、癌旁、正常组织的PCR产物量/β-actin的比值分别为36.65±0.30，44.84±0.54，86.34±0.73，胃癌、癌旁组织中的表达显著低于正常组织(均P<0.01)。

　　2.2 STAT3基因的蛋白水平的表达 Western印迹法检测所有标本均有STAT3基因蛋白的表达，但正常组织中表达较弱，癌组织中表达最强，癌旁组织次之。STAT3蛋白量/β-actin蛋白量的比值(%)分别为77.64±5.44，73.19±4.42，34.24±1.10，经t检验分析,胃癌、癌旁组织中的表达与正常组织相比有显著性差异(均P<0.01)。免疫组化检测15例标本中7例癌及癌旁组织有STAT3基因蛋白的表达，阳性率为46.67%。正常组织中有2例呈弱阳性表达。STAT3蛋白以胞浆表达为主，磷酸化STAT3蛋白以胞核表达为主。见图1。

　　图1 免疫组化检测STAT3蛋白的表达(略)

　　3 讨论

　　STAT3于1994年作为IL-6信号传递中的急性反应因子被发现并被纯化〔7〕，且越来越多的证据支持STAT家族在肿瘤形成过程中起重要作用，尤其是STAT3 和STAT5 〔8～10〕。酪氨酸磷酸化是STAT3的活化形式，持续激活可导致细胞异常增殖和恶性转化。尽管有关STAT3的研究主要集中于白血病、多发骨髓瘤、乳腺癌、前列腺癌、黑色素瘤、肺癌等，但近年关于STAT3在胃癌中的研究提示STAT3的异常活化与胃癌的发生发展密切相关。Jenkins等〔11〕研究显示高度激活的STAT3可以关闭肿瘤细胞生长的关键调节因子肿瘤生长因子β-(TGF-β)的表达，从而导致肿瘤的发生，首次确认了胃癌与STAT3信号通路之间的联系，将STAT3确定为胃癌治疗的一个新的靶点。Yakata等〔12〕应用免疫组化法检测111例胃腺癌组织，p-STAT3的阳性率为49.5%，而且与临床病理因素密切相关，阳性病例预后不良，因此认为STAT3的组成性激活在胃腺癌的发生中起重要作用。Jackson等〔13〕在研究幽门螺杆菌相关性胃癌发生机理中，发现幽门螺杆菌相关性胃炎中STAT3 和ERK1/2表达明显增高，幽门螺杆菌感染后IL-6表达增高，而在胃癌组织中IL-6 和白细胞介素-11(IL-11)表达均明显上调，IL-11的高表达与腺癌的发生相关，可能的机制是通过促STAT3活化导致细胞增殖。

　　本研究证实在人胃癌及癌旁组织中存在STAT3基因的高表达，包括转录水平的增高及蛋白表达水平的增高，与正常胃组织有显著差异，提示STAT3的异常激活可能发生在胃癌的早期。生理情况下，无活性的STAT3存在于胞浆中，接受信号刺激后形成磷酸化STAT3，进入胞核启动下游基因转录，随即降解，我们同时检测了磷酸化STAT3蛋白的表达，发现其在胞核中大量表达，支持STAT3的持续磷酸化可能是引发细胞恶性转化的重要环节。同时检测的c-myc、 survivin、VEGF基因被认为是STAT3基因的下游基因，在胃癌及癌旁组织中的表达亦高于正常胃组织，而p53基因mRNA在胃癌及癌旁组织中的表达低于正常胃组织。c-myc为细胞增殖及凋亡双向调节因子，当促癌因素为主时表现为促进细胞增殖作用;survivin为凋亡蛋白抑制因子，在凋亡和细胞周期的基因调控中发挥重要作用〔14〕。本组结果显示survivin在正常组织中无或微弱表达，在癌旁组织中弱表达，在癌组织中强表达，提示其为癌变晚期指标;VEGF是强效力的促血管生成因子，可促进肿瘤的血管生成，与肿瘤的发生发展及转移关系密切〔15〕;p53基因是重要的促凋亡因子，有报道STAT3在体内及体外实验中均可与p53启动子结合，其DNA结合位点的特异性突变可影响p53基因的活性〔16〕。据此推断在胃癌的发生发展过程中，STAT3的异常增高及持续磷酸化，可启动其下游基因的持续活化，并阻断了某些重要抑癌基因的活性，其致癌机制为促进细胞增殖、抑制细胞凋亡、促血管生成而加快转移。因而STAT3基因可望成为胃癌的诊断指标及治疗的靶点。

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