印迹基因PEG10在胃癌中的表达及其与幽门螺杆菌感染的关系
发表时间：2010-07-27 浏览次数：415次
作者：王凯 丁大勇 马冲 朴云峰 作者单位：吉林大学第一临床医院消化内科，吉林 长春 130021
【摘要】 目的 探讨印迹基因PEG10在胃癌组织中的表达特点及其与幽门螺杆菌(Hp)感染的关系。方法 采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测40例胃癌、癌旁组织中印迹基因PEG10的mRNA水平;采用免疫组织化学染色技术及Warthin-Starry银染法检测42例胃癌、癌旁组织及6例正常胃组织中PEG10蛋白的表达及Hp感染情况。结果 RT-PCR结果显示20例胃癌组织中9例(45.0%)PEG10 mRNA表达，对应的癌旁组织仅有2例(10%)表达;免疫组织化学染色结果显示42例胃癌组织中22例(52.38%)PEG10蛋白表达阳性，对应的癌旁组织仅有5例(11.90%)PEG10蛋白表达阳性，正常胃组织无PEG10蛋白表达;Hp银染法结果显示42例胃癌组织中25例(59.52%)为Hp感染阳性，癌旁组织20例(47.62%)Hp感染阳性;22例PEG10阳性表达胃癌组织中20例Hp感染阳性。结论 PT-PCR结果与免疫组织化学染色结果具有一致性,即PEG10 mRNA及蛋白在胃癌组织和癌旁组织中的表达率比较差异有显著性(P<0.05);PEG10在胃癌组织中的表达与Hp感染呈正相关(P<0.05)。
【关键词】 印迹基因;PEG10;胃癌;Warthin-Starry银染法;免疫组织化学染色
基金项目：吉林省科技厅资助课题(200505219)
Correlation of PEG10 expression and its relation to helicobacter pylori infection in human gastric carcinoma
WANG Kai, DING Da-Yong, MA Chong, et al.
Department of Digestive Medicine, First Hospital, Jilin University, Changchun 130021, Jilin, China
【Abstract】 Objective To investigate the expression of a novel imprinted gene, PEG10, in human gastric carcinoma, and its ralationship to helicobacter pylori (Hp) infection. Methods PEG10 mRNA expression in 40 cases of gastric carcinoma and the corresponding adjacent normal tissues were detected by RT-PCR. PEG10 protein expression in 84 cases of gastric carcinoma, and the corresponding adjacent normal tissues and 6 cases of normal gastric tissues were detected by immunohistochemistry. The infection of Hp was measured by Warthin-Starry stain. Results RT-PCR result showed PEG10 mRNA expression in gastric carcinoma of 9 cases (45.00%) and in corresponding adjacent normal tissues of 2 cases (10.00%). Immunohistochemistry results showed positive PEG10 protein expression in gastric carcinoma of 22 cases (52.38%) and in corresponding adjacent normal tissues of 5 cases (11.90%), no expression of PEG10 in nomal gastric tissues. Warthin-Starry stain showed among 42 cases of gastric carcinoma, positve Hp infection in gastric carcinoma tissue of 25 cases (59.52%), in corresponding adjacent normal tissues of 20 cases (47.62%); there were 20 cases of positive Hp infection in gastric carcinoma among 22 cases of PEG10 positive expression.Conclusions RT-PCR result is same as immunohistochemistry stainning′s, there is significant difference in PEG10 mRNA and protein between gastric tissue and the corresponding adjacent normal tissue. PEG10 overexpressed in gastric carcinoma is positively correlated with Hp infection.
【Key words】 Imprinted gene; PEG10; Gastric carcinoma; Warthin-Starry stain; Immunohistochemistry
PEG10(Paternally Expressed 10)是近年发现的一个重要的印迹基因,与消化道肿瘤相关。研究发现PEG10在原发性肝癌组织及细胞株中表达上调〔1〕，认为此印迹基因在原发性肝癌癌变过程中起很重要的作用，可以作为原发性肝癌进展的评估指标。目前PEG10在胃癌中的表达及其与胃癌的关系尚无相关研究。本文旨在研究印迹基因PEG10在胃癌中的表达水平及该基因的表达与幽门螺杆菌(Hp)感染的相关性，为进一步明确HP感染在胃癌癌变过程中的作用提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料 胃癌组织及其癌旁组织取自2004年6月～2007年2月于中日联谊医院胃肠外科行手术切除的42例标本(男30例，女12例，年龄50～65岁)，正常胃组织取自同期因十二指肠溃疡行胃大部切除术的6例标本(男4例，女2例，年龄36～55岁)中距病变肉眼边缘4cm以上胃组织。其中20例癌与癌旁标本离体后立即分别取0.5 cm组织置于液氮保存，然后储存到-80℃深低温冰箱保存，用于提取RNA。所用标本经10%甲醛固定，石蜡包埋。
反转录试剂盒购自Fermentas公司，引物合成由上海生工公司完成，兔抗人PEG10多克隆抗体及通用型S-P免疫组化试剂盒购自武汉博士德生物公司。
1.2 方法
1.2.1 组织及细胞系总RNA提取、逆转录反应及PCR 应用Trizol试剂，按照说明书提取胃癌组织、癌旁组织总RNA。逆转录反应合成cDNA。取1 μl产物进行PCR扩增。反应条件为：95℃变性5 min，95℃ 60 s,60℃ 60 s,72℃ 90 s,32个循环;72℃延伸8 min。PEG10上游引物序列：5′- AACAACAACAACAACTCCAAGC;下游引物序列：5′- TCTGCACCTGGCTCTGCAG。内参GAPDH上游引物序列：5′-GGGGAGCCAAAAGGGTCATCATCT;下游引物序列5′-GAGGGGCCATCCACAGTCTTCT。反应结束后取产物于1.0%琼脂糖凝胶中电泳。
1.2.2 免疫组织化学染色 石蜡包埋标本4 μm厚连续切片分别用于HE染色及免疫组织化学染色。免疫组织化学染色采用链霉素亲和素-生物素-过氧化酶复合物法(SP法)常规进行。以细胞出现清晰黄棕色颗粒为阳性判定标准，结果以阳性细胞数的百分比来表示，即光镜(×400)下随机选取10个高倍镜视野，每个视野计数50个细胞，阳性细胞数<10%为阴性，阳性细胞数10%～15%为弱阳性(+)，阳性细胞数>15%为强阳性()。PBS代替一抗作阴性对照。
1.2.3 Warthin-Starry染色法 石蜡包埋标本4 μm厚切片脱蜡至水浸入1%硝酸银液中,43℃、30 min;在切片上滴显影液1～2 min,切片呈棕黄色;用56℃水快速冲洗;蒸馏水冲洗;脱水、透明、封片。常规行油镜观察细菌形态，Hp呈黑色,典型的呈S状或海鸥状弯曲，周围有光晕。全片只要有少数典型包括“C”型或“S”型的Hp即可诊断。
1.3 统计方法 应用SPSS13.0软件的比较及相关性分析采用χ2检验。
2 结果
2.1 胃癌及癌旁组织中PEG10基因的表达 对胃癌及配对的癌旁组织进行RT-PCR检测，得到单一目的条带，大小为282 bp(图1)。所检测的20例胃癌、癌旁组织标本中，9例胃癌组织PEG10表达(45.0%)，2例(10.0%)癌旁组织PEG10表达。6例正常胃组织无PEG10表达。
C为胃癌组织，N为对应的癌旁组织
图1 RT-PCR检测胃癌组织及对应癌旁组织中PEG10表达(略)
图2 胃癌组织PEG10免疫组织化学染色结果(×200)(略)
2.2 免疫组织化学染色 见图2。在42例胃癌组织中，11例PEG10蛋白染色为强阳性(),11例为弱阳性(+),表达率为52.38%;相应癌旁组织亦有5例为弱阳性(+),表达率为11.90%，标本染色呈棕黄色，聚集于细胞质内,核无染色。胃癌组织与癌旁组织表达率之间差异有显著性(P<0.05)。正常胃组织无PEG10表达。
2.3 Hp Warthin-Starry染色 在42例胃癌组织中25例(59.52%)Hp感染阳性;癌旁组织20例(47.62%)Hp感染阳性;在6例正常胃组织中2例(33.33%)Hp感染阳性(图3)。
图3 胃癌组织Hp嗜银染色结果(略)
2.4 PEG10表达与HP感染相关性 在42例胃癌组织中，PEG10蛋白染色阳性为22例(52.38%)，HP感染阳性为25例(59.52%)，两者之间呈正相关(P<0.05)。
3 讨论
基因印迹(genomic imprinting)是指不遵从孟德尔定律，依靠单亲传递遗传学性状的现象，指一对同源染色体或等位基因之间存在着功能上的差异，或者活性的差别。具有这种现象的基因称为印迹基因( Imprinted Gene)〔2〕。印迹基因与多种人类肿瘤相关，特别是它与消化道肿瘤的关系正逐渐引起人们的重视〔3〕。 PEG10是新近发现的一个重要的印迹基因，定位在人染色体7q21上，同时也被证明是一个癌基因 〔4〕。
本研究表明胃癌组织中PEG10在mRNA水平及蛋白水平的表达均高于癌旁组织，而正常胃组织无PEG10表达，说明印迹基因PEG10与胃癌癌变关系密切。本研究中胃癌组织相对应的癌旁组织中也有11.90%存在PEG10的表达，而病理切片提示这些癌旁组织并无形态学改变,说明癌旁组织虽然在形态上可以无明显肿瘤样改变，但从分子水平来看，它们并不完全正常,PEG10基因上调可能是胃癌发生的前期表现。
胃癌癌变是一个多基因参与多步骤发生的复杂过程,宿主的遗传背景和环境因素均对胃癌的形成起着不同程度的作用。目前已有证据表明Hp是胃癌的Ⅰ类致病因子，Hp感染与胃癌的发生和进展均显著相关，但是至今尚未发现Hp感染与胃癌发生之间的直接证据〔5〕。本研究表明PEG10在胃癌组织中的表达与Hp感染呈正相关。已有研究证实Hp感染促进胃癌癌变起始及进展过程中出现基因甲基化〔6〕。而对印迹基因的研究也表明基因印迹的产生及其控制主要依靠DNA差异甲基化维持。所以本研究结果在理论上可以解释为Hp的感染启动基因甲基化，导致印迹基因PEG10的激活，PEG10蛋白大量表达，与胃癌发生及发展密切相关。随着微生物学、分子生物学的深入研究,我们相信Hp感染导致胃癌发生的机制及印迹基因PEG10在胃癌癌变所起的作用会进一步阐明，为胃癌的防治开辟一条新的途径。
【参考文献】
1 Ip WK，Lai PB，Wong NL，et al.Identification of PEG10 as a progression related biomarker for hepatocellular carcinoma〔J〕.Cancer Lett，2007;250(2):284-91.
2 Barlow DP.Genetic imprinting in mammals〔J〕.Science,1995;270(5242):1610-3.
3 Derrane M.Gene imprinting:making an impression on cancer research〔J〕.J Natl Cancer Inst,1999;91(1):16-8.
4 Ono R,Kobayashi S,Wagatsuma H,et al.A retrotransposon-derived gene,PEG10,is a novel imprinted gene located on human chromosome 7q21〔J〕.Genomics,2001;73(2):232-7.
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6 Perri F，Cotugno R，Piepoli A,et al.Aberrant DNA methylation in non-neoplastic gastric mucosa of H.Pylori infected patients and effect of eradication〔J〕.Am J Gastroenterol，2007;102(7):1361-71.
