基于微小RNA的乙肝病毒RNA干扰表达载体的构建
发表时间：2010-07-26 浏览次数：423次
作者：唐彤宇 牛俊奇 姜艳芳 作者单位：吉林大学第一医院消化科，吉林 长春 130021
【摘要】 目的 为优化RNA干扰研究方法，构建了基于微小RNA的乙肝病毒RNA干扰表达载体。方法 利用网络工具设计针对乙型肝炎病毒S区的靶干扰序列，将单链寡核苷酸退火形成双链，克隆人pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR表达载体。结果 经酶切及测序鉴定，插入序列与靶序列一致，载体构建正确。结论 成功构建了新型乙肝病毒RNA干扰表达载体，为进一步体外及体内实验奠定了基础。
【关键词】 乙型肝炎病毒;RNA干扰;微小RNA;载体
慢性乙型肝炎全世界感染者达3.5亿〔1〕。在中国，乙型肝炎病毒慢性感染者约有1.7亿，每年约50万人死于肝癌或终末期肝硬化〔2〕。尽管抗病毒药物的出现为乙型肝炎的治疗带来了一线曙光，但疗效仍不满意。RNA干扰(RNAi)是继寡聚核苷酸和核酶技术之后又一新技术,在病毒、肿瘤、及功能基因组研究中发挥着日益重要的作用。本文旨在应用RNAi的最新研究成果，构建针对乙肝病毒(HBV)的S区的新型表达载体，为体内外研究RNAi技术抑制HBV的复制与表达奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料 pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR表达载体,各种限制性内切酶，感受态One Shot TOP10 Chemically Competent E.coli菌,T4 DNA连接酶,退火buffer均购自invitrogen公司。大观霉素购自鲁抗制药公司。单链寡核苷酸由北京鼎国生物有限公司合成。质粒提取试剂盒购自TAKALA公司。
1.2 方法 利用Invitrogen公司网上BLOCK-iT miR RNAi设计工具，设计针对HBV的S区的RNA干扰序列(gi:2812117)。经BLAST筛选得到两条microRNA单链核苷酸。Top：5′-TGCTGTAACCAGGACAAGTTGGAGGAGTTTTGGCCACTGACTGACTC CTCCAATGTCCTGGTTA-3′;Bottom:5′-CCTGTAACCAGGACAT TGGAGGAGTCAGTCAGTGGCCAAAACTCCTCCAACTTGTCCTG GTTAC-3′。经退火处理形成双链，与载体pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR连接后转化感受态菌TOP10，筛选后扩增，提取质粒。通过酶切并测序鉴定。
2 结果
以BamHⅠ和XhoⅠ双酶切，2%琼脂糖电泳，结果显示包含目的片段在内的约150 bp左右的条带，说明目的片段与载体正确连接。经上海生工生物工程技术公司测序，送检序列与Genbank对比，同合成序列相符(图1)，载体构建成功。
图1 测序结果(略)
序列中间斜体部分为靶序列，两侧下划线部分为载体侧翼序列中所带的限制性内切酶Sal I，BamH I，Bgl II，Xho I位点。
3 讨论
RNAi是存在于生物中的一种古老现象，是生物抵抗异常DNA(病毒、转座子和某些高重复序列)的保护机制，同时在生物发育过程中扮演着基因表达调控的角色，它可以通过降解RNA、抑制翻译或修饰染色体等方式发挥作用〔3〕。
RNAi存在两种既有联系又有区别的途径：siRNA(small interference RNA)途径和miRNA(microRNA)途径。siRNA途径是由dsRNA(double-stranded RNA)引发的，dsRNA被一种RNaseⅢ家族的内切核酸酶(Dicer)切割成21～26 nt长的siRNA，通过siRNA指导形成RISC蛋白复合物(RNA-induced silencing complex)降解与siRNA序列互补的mRNA而引发RNA干扰。而miRNA途径中，miRNA是含量丰富的不编码小RNA(21～24个核苷酸)，由Dicer酶切割内源性表达的短发夹结构RNA(hairpin RNA，hpRNA)形成。miRNA同样可以与蛋白因子形成RISC蛋白复合物，可以结合并切割特异的mRNA而引发RNAi〔4〕。尽管引发沉默的来源不同，但siRNA 和miRNA 都参与构成结构相似的RISC，在作用方式上二者相似。
由于受siRNA作用时间的限制，更多的RNAi研究是应用带有聚合酶Ⅲ启动子的短发夹RNA(shRNA)载体在哺乳动物细胞中表达产生siRNA。而聚合酶Ⅲ启动子在组织特异性表达中应用受限，因此，我们以带有聚合酶Ⅱ启动子的内源性miRNA的pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR载体进行实验研究。该载体以成熟的miR-155基本结构为框架〔5〕，并加以改进。连入载体的目的片段在体内将以内源性miRNA的角色发挥RNAi作用。本载体的成功构建为进一步在体内、外研究RNAi抑制HBV的表达奠定了基础。
【参考文献】
1 Maddrey WC.Hepatitis B：an important public health issue〔J〕.J Med Virol，2000;61(3):362-6.
2 Sun Z，Ming L，Zhu X,et al.Prevention and control of hepatitis B in China〔J〕.J Med Virol，2002;67(3):447-50.
3 Voinnet O，Pinto YM，Baulcombe DC.Suppression of gene silencing：a general strategy used by diverse DNA and RNA viruses of plants〔J〕.Proc Natl Acad Sci USA，1999;96 (24):14147-52.
4 Ambros V.The functions of animal microRNAs〔J〕.Nature,2004;431(7006):350-5.
5 Lagos-Quintana M，Rauhut R，Yalcin A,et al.Identification of tissue-specific microRNAs from mouse〔J〕.Curr Biol,2002;12 (9):735-9.
