PTEN表达载体的构建及转染食管鳞癌细胞系EC9706

　　作者：侯桂琴，鲁照明，薛乐勋，田芳，范天黎，刘兰琦，许培荣 作者单位：450052 郑州大学细胞生物研究室，郑州大学第一附属医院

　　【摘要】 目的 筛选稳定表达野生型PTEN基因的食管鳞癌细胞株EC9706。方法 提取胎盘总RNA，设计引物，PCR扩增人野生型PTEN基因，经测序鉴定后，连接于pcDNA3.1(+)真核表达载体，构建pcDNA3.1PTEN，用脂质体介导的方法将其转染EC9706。而后加抗生素G418筛选稳定表达株，用RTPCR方法检测稳定表达株PTEN基因的mRNA水平，通过绘制生长曲线观察细胞生长情况。结果 PCR产物的电泳结果显示，在1 500bp左右有一明显亮带，测序结果与GenBank上PTEN序列完全一致;稳定表达PTEN基因的细胞株RTPCR结果显示，PTEN的mRNA水平比对照细胞株相比明显升高;生长曲线结果显示，转染后的细胞生长速度明显减慢。结论 所扩基因为野生型PTEN基因，所构建的载体为野生型PTEN基因真核表达载体，并筛选出PTEN基因稳定表达的食管鳞癌细胞株。

　　【关键词】 PTEN;食管鳞癌;mTOR;转染

　　基金项目：教育部“十五”“211工程”重点学科建设项目(教重字[2002]第2号)

　　Construction of a Vector for Stable Expression of PTEN in Esophageal Squamous Cell Cancer Cell Line

　　HOU Guiqin，LU Zhaoming，XUE Lexun，TIAN Fang，FAN Tianli，LIU Lanqi，XU Peirong

　　Laboratory for Cell Biology，The First Affiliated Hospital, Zhengzhou University, Zhengzhou 450052，China

　　Corresponding Author：XUE Lexun，Email：lxxue@public2.zz.ha.cn

　　Abstract：Objective To establish stable expression cell line transfected with eukaryotic expression vector of PTEN. Methods To clone the wildtype PTEN gene, total RNA was isolated from human placenta tissues. A cDNA of human PTEN was obtained by optimized RTPCR and sequenced, and then the cDNA fragment was put into the eukaryotic expression plasmid pcDNA3.1(+) to construct pcDNA3.1PTEN. Cells of esophageal squamous cell cancer cell line EC9706 were transferred with pcDNA3.1PTEN using lipofectamine. The stable expression cells were screened by G418. RTPCR and growth curve were done for identifying the screened cells. Results The cDNA fragment produced by RTPCR had 100% homology with wildtype PTEN gene sequence on GenBank by BLAST. The mRNA level of PTEN increased notably in the cell line we screened, and the growth of the cell line was very solely compared with control cell lines. Conclusion Because of cells of esophageal squamous cell cancer which stably express PTEN were successfully screened, it is concluded that a PTEN eukaryotic vector for stable expression in esophageal squamous cell cancer cell line has been constructed.

　　Key words：PTEN;Esophageal cancer;mTOR;Transfection

　　0 引言

　　mTOR(Mammalian target of rapamycin)是一种进化上高度保守的丝/苏氨酸蛋白酶。越来越多的证据显示， mTOR信号转导在细胞的生存、生长与增殖中起中心调控作用，其通路的异常与多种恶性肿瘤有关[1]，已成为肿瘤治疗的新靶点[2,3]，雷帕霉素是mTOR的特异性抑制剂[4]。抑癌基因PTEN (phosphatase and tensin homolog deleted from chromosome 10)是1997年发现并被克隆的第一个具有双特异性磷酸酶活性的抑癌基因,并被证实与十几种人类肿瘤的恶性增殖和转移有关[5]。据报道，PTEN的缺失或突变可以使mTOR信号通路异常激活[6,7]。目前国内对PTEN的研究仅集中在肿瘤中PTEN蛋白的表达情况，PTEN基因突变检测及PTEN基因的抑癌效果方面[8,9]，而其表达水平变化对mTOR通路的影响及其引起的细胞对雷帕霉素敏感性的变化在国内外均未见报道。由于河南省是食管癌的高发区,故本研究以食管鳞癌为研究对象，从胎盘中克隆野生型PTEN基因，构建真核表达载体并转染食管癌细胞，筛选出稳定的表达株，为进一步研究PTEN与mTOR通路之间的关系提供了很好的实验基础。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　1.1.1 细胞株及组织

　　人食管鳞癌细胞株EC9706由本校病理教研室提供;正常人胎盘组织来源于河南省人民医院妇产科，液氮保存。

　　1.1.2 载体与宿主菌

　　pcDNA3.1(+)载体购自Invitrogen公司，pMD18T 载体购自大连宝生物公司;大肠杆菌JM109由本室保存。

　　1.1.3 酶及试剂

　　内切酶及试剂盒购自大连宝生物(TaKaRa)公司;DNA marker、IPTG、Xgal购自上海生物工程公司;G418为Sigma公司产品。

　　1.1.4 培养基

　　RPMI 1640培养基、胰蛋白酶、胎牛血清购自Gibco公司，含Amp的LB(LA)培养基本室配制。

　　1.1.5 引物

　　根据GenBank上登录的人野生型PTEN及Actin序列用Primer Premier 5.0软件设计三对引物。

　　引物1：PTEN全序列扩增引物：上游P1 5′AAG CTT ATG ACA GCC ATC ATC AAA GAG AT 3′，含HindⅢ酶切位点，下游P2 5′GGA TCC GGA ATA AAA CGG GAA AGT GCC 3′，含BamHⅠ酶切位点,下划线部分为相应酶切位点，序列全长为1 512bp;

　　引物2：PTEN的RTPCR检测引物：上游P11 5′TTG AAG ACC ATA ACC CAC CA 3′下游P22 3′GGT CAG TCT CCG CGA TAC AC 5′长度为257bp;

　　引物3：内参Actin基因引物：上游AP1：5′ACC AAC TGG GAC GAC ATG GAG AAA ATC 3′,下游AP2：5′GTA GCC GCG CTC GGT GAG GAT CTT CAT 3′,长度为409bp。引物均由北京奥克生物工程公司合成。

　　1.2 方法

　　1.2.1 胎盘总RNA的提取

　　将约50mg液氮保存的胎盘组织剪碎，然后按Trizol试剂说明书提取总RNA。

　　1.2.2 PTEN基因的RTPCR扩增

　　根据TaKaRa一步法RNA PCR Kit 说明书进行,反应体系50μl。RTPCR扩增条件: 50℃ 30min，94 ℃ 2min;94 ℃ 30sec，52 ℃ 30sec，72℃ 6min，共35个循环;继之72 ℃延伸10min，4℃终止。结束后取5μl 产物电泳检测。

　　1.2.3 PTEN基因的克隆及鉴定

　　回收PCR 产物并与T 载体连接,构建重组质粒pMD18PTEN，转化感受态大肠杆菌JM109，37℃过夜培养。随机挑取白色菌落，接种于LA液体培养基中，37℃震荡过夜培养。提质粒，HindⅢ和BamHI 37℃双酶切，酶切产物进行电泳鉴定。酶切鉴定正确的质粒测序。

　　1.2.4 真核表达载体的构建及鉴定

　　把经测序鉴定正确的重组质粒用HindⅢ和BamHⅠ双酶切，回收约1.5kb的PTEN片段;同样用HindⅢ和BamHⅠ双酶切pcDNA 3.1(+)载体，回收大片段。连接两片段并转化感受态大肠杆菌JM109，过夜培养，挑克隆，提质粒，双酶切鉴定。然后用无内毒素质粒提取试剂盒提取鉴定正确的质粒备用。

　　1.2.5 细胞培养

　　食管鳞癌细胞株EC9706用含10% FBS 的RPMI1640培养基于37℃、5% CO2、饱和湿度的培养箱中培养。

　　1.2.6 转染

　　接种细胞于24孔板中培养，当细胞达80%～90%融合时，按LipofectamineTM2000说明，把pcDNA 3.1PTEN 转染EC9706，以转染pcDNA3.1(+)空载体及不转染细胞为对照。培养24h后按600μg/ ml加入G418筛选阳性细胞克隆。

　　1.2.7 检测转染细胞中PTEN水平

　　培养阳性细胞克隆，提取细胞总RNA，RTPCR检测转染细胞中PTEN水平变化。

　　1.2.8 生长曲线绘制

　　稳定生长的阳性细胞克隆按1×104/孔接种于24孔板中，每天取3个复孔进行计数，共计7天，绘制生长曲线。

　　1.2.9 统计学处理

　　数值以±s表示，行单因素方差分析(ANOVA);抑制率=(处理孔细胞计数值对照孔细胞计数值)/对照孔细胞计数值，t检验，在SPSS13.0上完成。

　　2 结果

　　2.1 胎盘总RNA及PCR扩增结果

　　总RNA电泳结果显示，提取的RNA较完整，见图1。PCR扩增结果显示，在约1.5kb处有一明显亮带，见图2。

　　2.2 阳性克隆鉴定及测序结果分析

　　阳性质粒用BamHI和HindIII双酶切鉴定如图3显示，四个质粒均有大小正确的插入片段，测序结果与GenBank上人野生型PTEN基因序列完全相同。

　　2.3 筛选阳性细胞株

　　转染的食管鳞癌细胞培养24h后加600μg/ml G418进行筛选，2～3天更换1次新鲜培基，继续加G418筛选，至正常细胞全部死亡后停止筛选，两株转染细胞还有少数存活，即为阳性细胞。挑取阳性单克隆细胞至新培养孔中，低浓度G418(200μg/ml)维持培养。

　　2.4 RTPCR结果

　　与转染前的细胞相比，转染PTEN的细胞mRNA水平明显升高，而转染空载体的细胞无明显变化，见图4。内参为Actin,大小为409bp。

　　2.5 生长曲线

　　与未转染细胞相比，转染细胞生长速度明显减慢，而转染PTEN的细胞生长速度最慢，见图5。细胞计数结果及统计学处理，见表1。表1 三种细胞株计数结果及F值(略)注：1组代表未转染细胞株;2组代表转染空载体细胞株;3组代表转染重组载的体细胞株;从第3天开始，经单因素方差分析，3组间细胞计数有明显差异(P<0.001)

　　转空载体及重组载体在不同时间对细胞的抑制率见表2。经t检验，转空载体细胞和转PTEN重组质粒载体的细胞在第3天抑制率在统计学上无差异(P>0.05);从第4天开始，2组间的细胞生长抑制率有明显差异(D4～7均P<0.01)，即与转空载体细胞比较，转PTEN重组质粒载体的细胞生长明显受抑制。表2 3～7d转空载体细胞株和转重组载体细胞株的抑制率(略)注：本表中2组和3组第3～7天的抑制率按照公式[抑制率=(处理孔细胞计数值对照孔细胞计数值)/对照孔细胞计数值]计算得出。2组代表转空载体细胞株;3组代表转重组载体细胞株

　　3 讨论

　　抑癌基因PTEN作为迄今为止发现的第一个具有磷酸酶活性的抑癌基因，在十几种恶性肿瘤中广泛存在突变[10]，自发现以来一直是研究的热点。

　　mTOR又叫FRAP、RAFT1或RAP1，是新发现的蛋白激酶家族中的一员，在由磷酸肌醇激酶3(PI3K)/Akt传导通路介导的增生信号的传导中起重要作用。多数肿瘤中存在PTEN的缺失或突变，而PTEN的缺失或突变又可引起mTOR异常激活[11,12]。

　　从本试验结果可以看出，PCR扩增PTEN全序列的条带非常特异，而测序结果也表明所克隆的片段为野生型PTEN基因。根据转染细胞PTEN的 RTPCR结果，可以看出在转染PTEN的细胞中，PTEN的水平有了显著的升高，生长曲线图显示，转PTEN细胞比转空载体细胞及未转染细胞的生长速度明显减慢(从第3天开始P<0.001)。我们推测，转染细胞中PTEN蛋白表达确实对细胞生长起抑制作用，说明野生型PTEN已成功转入食管鳞癌细胞中。

　　总之，本试验克隆了人野生型PTEN基因并导入食管鳞癌细胞中，成功筛选出PTEN稳定表达株，且PTEN蛋白对细胞生长有抑制作用。由于食管鳞癌在河南的发病率高，并且PTEN在食管癌中的研究已取得了一定进展[13]，本研究筛选出的稳定表达株为进一步研究食管癌细胞中PTEN蛋白表达水平对mTOR通路的影响提供了实验依据，也为从分子水平上治疗食管癌奠定了基础。

　　致谢：本研究在河南省分子医学重点学科开放实验室完成

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