木黄酮对体外培养的HSCT6细胞基质金属蛋白酶抑制因子1基因表达的影响

　　作者：王云 作者单位：西安交通大学医学院第一附属医院消化内科，陕西西安 710061

　　【摘要】 目的 以雌二醇(E2)作为阳性对照，观察植物雌激素木黄酮(GST)对体外培养的HSCT6细胞基质金属蛋白酶抑制因子1(TIMP1)基因表达的影响。方法 E2 0.1μmol/L浓度作为阳性对照，GST 0.5、5、50μmol/L浓度分别作用于HSCT6细胞36h，以RTPCR方法测定其对HSCT6细胞TIMP1基因表达的影响。结果 E2浓度组和GST各浓度组均对HSCT6细胞TIMP1基因表达有明显的抑制作用，其中GST各浓度组作用呈一定剂量相关性。结论 GST各浓度组均可抑制HSCT6细胞TIMP1基因表达水平，从而促进胶原降解，可能是其抗肝纤维化的作用机制之一。

　　【关键词】 肝纤维化 雌二醇 植物雌激素木黄酮 基质金属蛋白酶抑制因子 肝星状细胞

　　Effects of genistein on the matrix metalloproteinase inhibitor 1　mRNA levels of HSCT6 cell in vitro

　　Wang Yun, Xu Junwang, Fu Lei

　　(Department of Gastroenterology, the First Affiliated Hospital, Medical School of　Xian Jiaotong University, Xian 710061; Department of Technology,Department of Traffic Administration, the Public Security Office of Xian, Xian 710082, China)

　　ABSTRACT: Objective By using estradiol (E2) as positive control to observe the effects of genistein (GST) on the matrix metalloproteinase inhibitor 1 mRNA levels of HSCT6 cell in vitro. Methods HSCT6 cells were exposed to different concentrations of E2 0.1μmol/L and GST 0.5-50μmol/L for 36 hours. The TIMP1 mRNA levels were measured by the quantitative reversetranscription polymerase chain reaction (RTPCR). Results The TIMP1 mRNA levels of HSCT6 cells at different concentrations of E2 and GST were lower than those of the normal control (P<0.01). We found that the more concentration of GST group the more inhibitory effects of the TIMP1 mRNA levels. Conclusion The antifibrotic mechanism of GST is partly due to its downregulation on TIMP1 mRNA levels of HSCT6 cells.

　　KEY WORDS: liver cirrhosis; estradiol; phytoestrogen genistein; matrix metalloproteinase inhibitor; hepatic stellate cell

　　雌二醇(estradiol, E2)作为雌激素抑制肝纤维化的潜在机制包括有自身作为抗氧化剂抗氧化及抗细胞凋亡的作用，也可通过直接受体机制等作用来抑制肝纤维化，并有大量实验证明雌激素可以抑制肝内基质金属蛋白酶抑制因子(inhibitor of metalloproteinase, TIMP)的表达，使基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase, MMP)的活性增强，抑制肝维化的产生[13]。而木黄酮(genistein, GST)作为植物雌激素的一种主要成分具有多种生理功能，木黄酮在结构上与哺乳动物的雌激素雌二醇相似，具有雌激素的活性基团二酚羟基[4]，其化学结构决定化学性质，所以GST具有类雌激素活性等多种生物活性。它不仅是一种有效的抗氧化剂，还是一种有效的酪胺酸蛋白激酶抑制剂。本实验以E2作为阳性对照，应用RTPCR方法进一步观察GST对体外培养的HSCT6细胞TIMP1基因表达的影响。

　　1 材料与方法

　　1.1 细胞系 肝星状细胞系HSCT6由美国加利福尼亚旧金山总医院肝病研究中心Frideman教授、上海第二军医大学张俊平教授惠赠。系SV40转染的大鼠肝星状细胞，具有活化的HSC表型[5]。

　　1.2 药品、试剂与仪器 木黄酮和雌二醇冻干粉购自美国Sigma公司;含酚红的高糖型DMEM液体培养基、无酚红的高糖型DMEM液体培养基购自Hyclone公司;总RNA提取试剂盒、逆转录盒、Markers和琼脂糖均为Promega公司产品;梯度PCR仪为美国Sigma公司产品;采用Bandscan图象分析软件。

　　1.3 方法

　　1.3.1 药液配制 GST冻干粉5mg以DMSO(370μL)溶解，制成浓度为50mmol/L的贮存液，使用前新鲜配制，用含5%体积分数血清的无酚红的高糖型DMEM培养液稀释至0.5、5、50μmol/L浓度;E2冻干粉3mg以DMSO(8760μL)溶解，制成浓度为1mmol/L的贮存液，使用前新鲜配制，用含5%体积分数血清的无酚红的高糖型DMEM培养液稀释至0.1μmol/L浓度，均4℃避光保存。

　　1.3.2 细胞培养 HSCT6细胞于37℃快速复苏，用含10%体积分数胎牛血清的含酚红高糖型DMEM培养液接种于50mL细胞培养瓶中，在37℃，5%体积分数CO2及饱和湿度下培养，隔天换液，每日于倒置显微镜下观察细胞形态和生长状况，待细胞生长至80%-90%密度时，给予传代，取生长状态良好细胞用于实验。

　　1.3.3 药物干预 取对数生长期培养细胞HSCT6，待细胞生长融合后，加入GST或E2，以不同浓度分组(GST不同浓度组：0.5μmol/L;5μmol/L;50μmol/L，E2浓度组：0.1μmol/L)，E2组作为阳性对照组，同时设未加任何药物的阴性对照组以及1‰DMSO对照组，进行下一步检测。

　　1.3.4 RTPCR检测HSCT6细胞TIMP1mRNA的表达 步骤如下：①提取RNA;②cDNA的合成：采用20μL逆转录反应体系，内含2μL总RNA，随即引物1μL，5×RT buffer 4μL，10mmol/L dNTP mix 2μL，Mmulv逆转录酶1μL，按25℃ 10min，42℃ 60min，70℃ 10min，置PCR仪上反应。冷却置-20℃冰箱保存;③PCR反应：PCR反应体系25μL，内含2×PCR Master Mix 12.5μL，cDNA 2.0μL，TIMP1上下游引物各1μL，加灭菌去离子水8.5μL至25μL混匀。PCR反应参数为：94℃预变性5min;94℃变性30s;53.3℃退火45s;70℃延伸1min;30个循环;70℃后延伸7min。TIMP1及内参照βactin的PCR引物均由Priemier primer引物设计软件设计合成，并经由Blast进行同源性分析。TIMP1的引物序列如下：上游引物5′GACCACCTTATACCAGCGTT3′，下游引物5′ATTATGCCAGGGAACCAGGA3′。扩增基因片段长度为229bp;βactin的引物序列如下：上游引物5′GTGGGGCGCCCCAGGCACCA3′，下游引物5′CTCCTTAATGTCACGCACGATTTC3′。扩增基因片段长度为540bp;产物分析：PCR产物在20g/L琼脂糖凝胶电泳后测灰度值，用TIMP1/βactin的比值表示TIMP1mRNA的相对表达水平，进行统计学分析。

　　1.4 统计学处理 所有数值均采用均数±标准差(±s)表示。应用SPSS13.0分析软件，进行多个样本均数比较的方差分析，显著性检验水准取α=0.05。

　　2 结果

　　E2和GST作用HSCT6细胞36h后，阴性对照组与DMSO 1‰组间比较无显著性差异，E2浓度组和GST低、中、高浓度组较阴性对照组及DMSO 1‰组均有显著抑制TIMP1mRNA表达的作用(P<0.01)，GST各浓度组对TIMP1mRNA表达的影响呈一定的剂量相关性。其中5、50μmol/L浓度GST较E2 0.1μmol/L浓度对TIMP1的基因表达有更为显著的抑制作用(P<0.01，表1)。琼脂糖凝胶电泳结果显示，1、2组为阴性对照组和DMSO 1‰组，目的条带较亮且并无明显差别，3、4、5组为E2低、中、高浓度组，其中第4组为E2 0.1μmol/L阳性对照组，可见目的条带亮度逐渐减弱;6、7、8组为GST低、中、高浓度组，目的条带亮度也逐渐减弱，同时可见7、8组目的条带亮度较第4组弱，这也符合灰度值统计分析结果(图1)。

　　表1 E2和GST对HSCT6细胞TIMP1mRNA水平的影响(略)

　　Table 1 Effects of E2 and GST on TIMP1 mRNA levels of HSCT6 cell in different groups

　　*P<0.01 vs. negative control group and group of 1‰ DMSO;▲P<0.01 vs. 0.1μmol/L E2

　　图1 TIMP1 RTPCR产物的凝胶电泳结果(略)

　　Fig.1 The transcription of TIMP1 mRNA in different groups

　　1: negative control group; 2: group of 1‰DMSO; 3: E2 10-2μmol/L; 4: E2 0.1μmol/L; 5: E2 1μmol/L; 6: GST 0.5μmol/L; 7: GST 5μmol/L; 8: GST 50μmol/L; 9: blank; M: 50bp DNA ladder marker

　　3 讨论

　　肝纤维化是各种慢性肝病发展的必经阶段，是由各种致病因子(如酒精、病毒、寄生虫等)引起肝脏的损伤和炎症，使HSC激活并转化为肌成纤维细胞(myofibroblast, MFB)，引起以胶原为主的细胞外基质(extracellular matrix, ECM)的合成大于降解，大量沉积导致纤维化，故促进ECM的降解已成为抗肝纤维化的研究热点。这个进行性的病理过程中，涉及细胞、细胞因子、ECM、MMP及TIMP等多种因素[6]。

　　反映ECM降解的指标主要有MMPs及TIMPs，在细胞外降解ECM的酶主要是MMP。MMP在细胞外间隙的基质转换中有关键性作用，随着肝纤维化发展，MMP活性逐渐增加，至肝纤维化晚期及肝硬变时MMP活性降低，已经激活的MMP在细胞外间隙又受到TIMP的调节。TIMP能有效地抑制MMP的活性，从而参与调节ECM的代谢过程。TIMPs对MMPs降解ECM的作用有普遍的抑制作用，通过抑制MMPs，阻止ECM的降解，从而形成或促进肝纤维化[7]。TIMP对MMP的抑制，被认为是肝纤维化产生的原因之一。TIMPs家族共有四个成员，其中TIMP1、TIMP2、TIMP3均可表达于肝[8]，而在肝纤维化研究中较多的是TIMP1和TIMP2，其中以前者在肝纤维化中的意义最大。对肝纤维化的诊断，TIMP1的特异性和敏感性均明显高于TIMP2。因此，越来越多的研究人员将TIMP1看作是肝纤维化发生过程中一个非常重要的促发因素。

　　雌激素是一类甾体类激素，它的靶器官主要是生殖系统。但是，近年来的研究表明肝脏的实质细胞和一些非实质细胞同样存在雌激素受体，雌激素参与肝脏的许多生理活动，其中在肝纤维化过程中的作用就是一个方面[9]，而E2作为生物活性最强的一种雌激素已在大量实验中证明可以抑制活化HSC的增殖、转化和胶原的合成，使肝内表达αSMA的区域缩小，同时降低Ⅰ、Ⅱ型前胶原mRNA和TIMP1的mRNA表达[2,10]。然而，在过去10年中有大量证据表明绝经后妇女长期应用激素替代治疗弊大于利，如增加患乳腺癌的风险，特别是治疗超过十年的患者。因此，天然的植物雌激素作为一种甾体激素以外的性激素替代物引起了人们的广泛关注，植物雌激素能产生类似雌激素的多种生物效应，却比传统的雌激素疗法具有更多优势：①来源于大自然，在大豆及其制品中含量丰富;②缓解因绝经而产生的一系列病症而不会导致乳腺癌和子宫内膜癌的发生;③用于心血管疾病和骨质疏松症的防治，而副作用如增加某些生殖系统的肿瘤、血栓形成的危险性相对较低;④应用于男性群体而不会导致女性化改变等等。植物雌激素具有抗增殖、抗氧化、诱导细胞凋亡、调解免疫力功能等生物学作用，其在改善围绝经期症状、降低血脂水平、防止骨质疏松、预防尿失禁等方面有着非常有益的作用[11]。尤其是其弱雌激素方面的作用，已有研究表明GST对心肌成纤维细胞的增殖有抑制作用，其机制是通过显著影响细胞周期，并将细胞周期抑制在G2/M期来实现的[12]。本实验室前期研究证明GST的抗肝纤维化的机制可能有以下几个方面：①抑制已活化的HSC的增殖和转化，减少细胞外基质的产生，抑制肝纤维化的形成;②可增加肝星状细胞的雌激素受体的表达，从而增强其对HSC的效应，发挥抗肝纤维化的作用;③作为抗氧化和酪氨酸蛋白激酶抑制剂的GST，可能对HSCT6细胞的凋亡产生促进作用，这可能也是其抑制肝纤维化形成的机制之一。但是，GST作为植物雌激素的一种主要成分对HSCT6 TIMP1的基因表达的影响还未见报道。本实验也正是想以E2作为阳性对照，阐明GST是否也能通过抑制TIMP1的基因表达从而达到抗肝纤维化的作用。而本实验应用RTPCR方法验证了以前实验研究对E2抑制TIMP1mRNA表达的结果，同时也观察到了GST各浓度组对HSCT6细胞TIMP1mRNA表达亦均有明显的抑制作用，其中GST的中、高浓度较E2阳性对照组对TIMP1mRNA表达的抑制作用更为明显，从而降低抑制MMP，促进对ECM的降解。提示植物雌激素木黄酮抗肝纤维化的作用还可能是通过抑制基质金属蛋白酶抑制因子1(TIMP1)的基因表达这一机制来实现的。因此，我们相信其在肝纤维化防治方面将有着更广阔的临床应用前景。

　　【参考文献】

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