Notch在肝细胞癌中的表达及意义

　　作者：任雪霞， 徐正府， 黄介飞， 鄂群 作者单位：1南通大学附属医院消化内科， 南通 226001;2南通大学医学院病理解剖学教研室

　　【摘要】 目的：探讨Notch1~4在肝细胞癌中的表达特点及其肿瘤生物学意义。方法：采用免疫组织化学染色方法检测36例肝细胞癌及其癌旁组织中的Notch1~4的表达。结果：Notch1~4在肝细胞癌中的表达分别为16例(44.44%)、11例(30.56%)、15例(41.67%)、19例(52.78%)，在癌旁组织中的表达分别为24例(66.67%)、17例(47.22%)、22例(61.11%)、27例(75.00%)。Notch1、Notch2和Notch4在肝细胞癌中下调(P<0.05)。结论：不同的Notch在肝细胞癌中的生物学行为不尽相同，Notch1、Notch2和Notch4表达下调，可能具有抑制肿瘤生长的作用。

　　【关键词】 肝细胞癌;Notch;免疫组织化学法;癌旁组织

　　Notch expression in hepatocellular carcinoma and it’s oncological significance

　　1REN Xuexia，1XU Zhengfu，1HUANG Jiefei，et al (1Department of Gastroenterology，Affiliated Hospital of Nantong University，Nantong 226001;2Pathological Department of Medical College，Nantong University)

　　[Abstract] Objective: To study the expression of Notch1~4 in hepatocellular carcinoma(HCC) and analyze it’s oncological significance. Methods: Immunohistochemical staining was used to measure Notch1~4 in the carcinomatous tissues and pericarcinomatous tissues in 36 cases of HCC. Results: The expressions of Notch 1~4 in carcinomatous tissues were 44.44%(16/36)，30.56%(11/36)，41.67%(15/36)，and 52.78%(19/36) respectively，but in the pericarcinomatous tissues they were 66.67%(24/36)，47.22%(17/36)，61.11%(22/36)，and 75.00%(27/36) respectively. Notch1，Notch2 and Notch4 were down-regulated in HCC(P<0.05). Conclusion: The different Notch has distinctly biological significance in HCC. The down-regulation of Notch1，Notch2 and Notch4 may indicate that they can suppress the development and progression of HCC.

　　[Key words] Hepatocellular carcinoma;Notch;Immunohistochemistory method;Pericarcinomatous tissue

　　Notch是进化过程中高度保守的局部细胞信号结构，参与多种细胞活动，决定细胞命运，在细胞分化、增殖、调亡等方面发挥重要作用[1]。Notch基因最初于1919年在果蝇体内被发现，Notch突变可影响果蝇的翅膀、眼及刚毛的形成，甚至在胚胎期造成致死性的神经发育障碍。Notch基因编码的跨膜受体是一个300 kD(p300)的单链跨膜蛋白，在细胞膜形成一个由180 kD(p180)和120 kD(p120)多肽段构成的异二聚体。p180包含大部分的胞外区，p120则包含跨膜区和胞内区，其胞外区和胞内区均高度保守。当配体结合到胞外区，Notch蛋白发生2次断裂。释放Notch胞内区(ICN)进入细胞核发挥生物学作用[2]。目前在脊椎动物中共发现了4种Notch同源体，包括Notch1、Notch2、Notch3和Notch4。近年来Notch信号途径成为发育生物学、神经学、血液学及肿瘤学等许多领域的研究热点之一。本研究采用免疫组织化学S-P法联合检测Notch1~4在肝细胞癌及对应的癌旁组织中的表达，旨在探讨不同Notch在肝细胞癌中的表达和作用。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料 (1)实验对象：2006年6月~2008年1月南通大学附属医院和南通市肿瘤医院手术切除的肝癌和对应的癌旁组织标本36例，-80 ℃保存备用。4%多聚甲醛固定后，常规石蜡包埋，4 μm厚连续切片。术后肿瘤组织均病理证实为肝细胞癌;(2)主要试剂：山羊抗人Notch1多克隆抗体和兔抗人Notch3多克隆抗体为Santa Cruz Biotechnology公司产品;山羊抗人Notch2多克隆抗体和鼠抗人Notch4单克隆抗体为R&D Systems公司产品;免疫组化检测试剂盒购自上海晶美生物技术公司;多聚-L-赖氨酸购自福州迈新生物技术开发公司;DAB试剂盒购自北京中山生物技术有限公司。

　　1.2 方法 (1)载玻片处理：玻片经洗涤剂浸泡，自来水清洗后泡酸过夜，再自来水中漂洗，蒸馏水冲洗，烤箱干燥后用稀释的多聚-L-赖氨酸溶液包被，于室温下晾干备用;(2)染色步骤：石蜡切片常规脱蜡至水，PBS冲洗。抗原修复：在10 mM柠檬酸钠缓冲液(pH 6.0)中加热沸腾切片1 min，随后沸点以下温水中浸9 min后PBS冲洗。1%过氧化氢孵育10 min，消除内源性过氧化物酶后PBS冲洗。封闭液室温下封闭1 h吸去封闭液。分别加山羊抗人Notch1多克隆抗体(1∶50)、兔抗人Notch3多克隆抗体(1∶50)、山羊抗人Notch2多克隆抗体(10 μg/ml)和鼠抗人Notch4单克隆抗体(10 μg/ml)，4 ℃冰箱过夜。加生物素标记的二抗至每张切片，室温下孵育30 min后PBS冲洗。DAB显色后苏木素复染。梯度乙醇脱水、二甲苯透明后封盖玻片。用已知阳性片作为阳性对照，用PBS替代第一抗体作为阴性对照;(3)结果判断：参照邢传平等[3]的标准，先在200倍的显微镜下随机观察5个视野，计算阳性细胞数的平均百分数作为该切片的阳性细胞百分比进行分级，以四级分法，即阳性细胞数≤25%为弱阳性(+)，26%～50%为阳性(++)，>50%为强阳性(+++)，无阳性细胞为阴性(-)。

　　1.3 统计学方法 全部数据均采用Stata7.0统计软件进行统计分析。配对等级资料用Wilcoxon配对秩和检验，检验水准α=0.05。

　　2 结 果

　　免疫组化染色方法观察Notch-1、2、3、4的表达。光镜观察可见，Notch1~4蛋白主要分布在细胞浆中，胞浆阳性的细胞中有少量细胞核和细胞膜着色，当出现核着色时，可被认为有核易位或活化现象。Notch1~4蛋白的表达情况见表1。

　　3 讨 论

　　Notch信号途径在参与胚胎发育、维持造血干细胞自我更新、调控牙齿的正常形成等方面发挥重要作用。在正常情况下，Notch信号的功能是使多种不成熟细胞暂时维持在未分化状态，以调节细胞对分化诱导因子的反应，并使未分化细胞保持一定的数量。当Notch信号异常地持续存在时，细胞不能正常分化而过度增殖，很可能就形成肿瘤。目前许多研究显示Notch在肿瘤的发生、生长过程中起重要作用，其在肿瘤中的重要作用有：维护未分化状态;参与细胞命运的决定;诱导终未分化，另外Notch还可通过调节肿瘤血管新生对肿瘤起作用[4]。人类许多肿瘤如宫颈癌、头颈肿瘤、肾癌、肺癌、乳腺癌、恶性黑色素瘤、霍奇金淋巴瘤、B淋巴细胞白血病等均发现Notch信号通路异常表达[5]。但Notch与肿瘤的关系是复杂的，不同的Notch受体在不同的肿瘤和肿瘤发展的不同阶段所起的作用是不同的。在T细胞白血病、乳腺癌、胶质细胞瘤，Notch是一个促癌基因[6-7]，而在其他肿瘤如小细胞肺癌和肺腺癌细胞株中，Notch表现为肿瘤抑制作用[8]。另外，Notch在宫颈癌低恶性程度肿瘤中高表达，而在更具有侵袭性高恶性程度的宫颈癌中则呈低表达。Notch既具有促癌作用，也具有抑癌作用[9]。

　　本实验采用免疫组化检测了4种Notch受体在肝细胞癌及其癌旁组织中的表达，Notch1~4在癌旁组织中阳性表达率均比癌组织中高，4种Notch受体中Notch2无论在癌还是癌旁组织中表达率均最低，但其同Notch1和Notch4一样，癌旁中表达阳性率高。Notch3在癌和癌旁组织中表达比较差异无统计学意义。Gramantieri 等[10]通过检测正常和肝硬化组织及肝癌组织中Notch 受体(Notch1，2，3，4)的mRNA 和蛋白质表达水平。发现与正常肝组织及硬化肝组织相比，在所有20 例肝癌样本中，Notch3、4 被下调，在其中13 例样本中Notch1～4都出现了下调。作者认为这可能与细胞分化失调有关。本研究中Notch1、Notch2和Notch4在肝细胞癌中出现下调，说明其具有抑制肝细胞癌生长的作用。Notch的抑制作用可通过诱导NF-kappaB的活性改变引起异常的有丝分裂，增加细胞在有丝分裂G0和G1期，诱导细胞凋亡。另外可增加细胞周期蛋白B1表达导致肿瘤细胞死亡[11-12]。Yao等[13]的研究也证实Notch1在NF-kappaB的参与下促进宫颈癌细胞周期停滞及细胞的凋亡。但是Notch信号分子对细胞凋亡的调节效应有时间依赖性和浓度依赖性[14]。另外，Notch1作为p53的靶基因在角质细胞癌细胞株中起到抑制肿瘤生长的作用[15]。

　　本文结果显示尽管同属一个家族，但Notch1、Notch2、Notch3和Notch4在肝细胞癌中的生物学行为却不尽相同。Notch的信号转导是一个即简单又复杂的过程。其简单表现在：当Notch受体与配体结合后，活化的Notch受体从胞膜脱落下来可直接转至核内，与转录调节子结合而激活靶基因。其复杂性表现在：多种Notch受体、配体共同存在;激活Notch可以引发多条信号途径;许多胞外和胞内蛋白能通过不同的机制调节Notch信号;Notch受体的表达水平影响了Notch信号的效应[16]。在不同的肿瘤和肿瘤发展的不同过程中，Notch信号途径有不同的作用，其可能的原因有：(1)Notch广泛存在于许多组织细胞中，不同的刺激信号都能激活Notch通路，Notch信号通路具有“共享性”;(2)Notch通路的受体、配体和靶基因有不同的类型，在不同的组织或肿瘤发展的不同阶段，相同Notch受体的作用也可能是不同的;(3)细胞内其他信号通路，如Ras、Wnt-1等也可通过激活Notch途径调控细胞的生长[17]。本实验通过4种Notch受体在肝细胞癌和癌旁组织中的比较研究，为进一步探讨Notch与肝细胞癌的关系提供理论依据。

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