三甲益肝冲剂对实验性肝纤维化大鼠脂质过氧化的影响

　　作者：张超贤，乔汉臣，杨道坤，秦咏梅 作者单位：1. 新乡医学院第一附属医院消化内科，河南卫辉 453100;2. 新乡医学院第一附属医院感染科，河南卫辉 453100

　　【摘要】目的 观察三甲益肝冲剂对大鼠肝纤维化的作用并探讨与抗脂质过氧化有关的作用机制。方法 雄性SD大鼠40只，随机分为模型组、复方丹参组、三甲益肝冲剂组和正常组。以二甲基亚硝胺(DMN)腹腔注射诱导大鼠肝纤维化模型，复方丹参组造模同时给予复方丹参灌胃，三甲益肝冲剂组造模同时给予三甲益肝冲剂灌胃，共4周。4周后处死大鼠取肝组织标本，光镜观察肝组织的病理变化，放射免疫法测定血清丙二醛(MDA)含量和超氧化物歧化酶(SOD)活性。结果 与正常组比较，模型组肝组织Masson染色胶原纤维面积和血清MDA含量显著增加(P<0.05)，而血清SOD活性明显下降(P<0.05);与模型组比较，三甲益肝冲剂组Masson染色胶原纤维面积和血清MDA含量显著下降(P<0.05)，而SOD活性明显升高(P<0.05)。Masson 染色胶原纤维面积和血清MDA含量表达呈正相关关系(r=0.435, P<0.05)，与SOD活性呈负相关关系(r=-0.358, P<0.05)。结论 三甲益肝冲剂具有良好的抗实验性大鼠肝纤维化作用，其主要作用机制与抗肝脏脂质过氧化损伤有关。

　　【关键词】 肝纤维化;三甲益肝冲剂;肝星状细胞;脂质过氧化

　　Effects of Sanjia Yigan Granule on lipid peroxidation

　　in rats with hepatic fibrosis

　　Zhang Chaoxian, Qiao Hanchen, Yang Daokun, Qin Yongmei

　　(1. Department of Gastroenterology, the First Affiliated Hospital of Xinxiang Medical College,Weihui 453100; 2. Department of Infectious Diseases, the First Affiliated Hospital ofXinxiang Medical College, Weihui 453100, China)

　　ABSTRACT: Objective To observe the effects of Sanjia Yigan Granule (SJG) on hepatic fibrosis and explore its mechanism related to antilipid peroxidation in rats. Methods Forty male SD rats were randomly divided into four groups: normal group, model group, and compound Salviae Miltiorrhizae (Sm) group and SJG group. Dimethylnitrosamine was injected intraperitoneally for 4 weeks to induce hepatic fobrosis. At the same time of modeling, Sm and SJG were given in the corresponding groups. The rats were killed after four weeks. The histomorphylogic structure of the liver tissues was observed under optical microscope; the levels of MDA and SOD in serum were determined by radioimmunoassay. Results Compared with those in normal group, the collagen area in Masson staining and level of serum MDA were inreased obviously, and the level of serum SOD was dereased obviously in model group (P<0.05). Compared with those in model group, the collagen area and level of serum MDA were dereased obviously, and the level of serum SOD was inreased obviously in SJG group (P<0.05). Highly positive correlation between collagen area and level of serum MDA was observed (r=0.435, P<0.05), and significantly negative correlation between collagen area and level of serum SOD was found (r=-0.358, P<0.05). Conclusion SJG has good antifibrosis effects in rats with hepatic fibrosis, and its mechanism may be correlated with its antilipid peroxidation.

　　KEY WORDS: hepatic fibrosis; Sanjia Yigan Granule; hepatic stellate cell; lipid peroxidation

　　脂质过氧化(lipid peroxidation)在肝纤维化过程中发挥重要作用，脂质过氧化的终产物丙二醛(malondialdehyde, MDA)可以激活静息状态的肝星型细胞(hepatic stellate cells, HSCs)，促使其合成与分泌大量的细胞外基质(extracellular matrix, ECM)而最终导致肝纤维化的形成[1]。因此，可通过抗脂质过氧化来达到抗肝纤维化的目的[2]。我院自制复方中药三甲益肝冲剂(Sanjiayigan Granule, SJG)具有活血化瘀、健脾益气、舒肝理气、软坚散结等作用，对治疗肝炎后肝硬化和慢性肝炎已取得良好效果[3]。本研究以二甲基亚硝胺(dimethylnitrosamine, DMN)诱导大鼠肝纤维化，以复方丹参(compound Salviae miltiorrhizae, Sm)作为治疗对照组，观察三甲益肝冲剂对大鼠肝纤维化的作用，并进一步探讨其与抗脂质过氧化的关系，以指导临床用药。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　雄性SpragneDawley(SD)大鼠，3月龄，40只，体重180-220g(新乡医学院实验动物中心提供);DMN(日本化成公司);三甲益肝冲剂(12g/袋，新乡医学院第一附属医院生产，产品批号071024，组方包括穿山甲、莪术、桃仁、丹参、郁金、赤芍、黄芪、白术、柴胡、内金、大黄等十五味。以蒸馏水稀释成0.34g/mL溶液);复方丹参滴丸(天津天力士制药股份有限公司生产，产品批号20070417，研细以蒸馏水稀释成8.1g/L溶液)。超氧化物岐化酶(SOD)、MDA检测试剂盒(南京建成生物工程研究所)。

　　1.2 动物分组及肝纤维化模型的建立

　　SD大鼠饲养笼饲养，自由饮水，标准饲料喂养。适应环境1周后，随机分4组：正常组、模型组、复方丹参组和三甲益肝冲剂组(n=10)。参考文献[4]方法造模，将DMN 335μL加0.15mol/L的氯化钠溶液中稀释至66.96mL，制备腹腔注射液，每周连续3d，按1次/d腹腔注射上述DMN稀释液2mL/kg(第1周为此剂量的2/3)，共4周。模型对照组造模同时予生理盐水灌胃，复方丹参组造模同时给予复方丹参滴丸蒸馏水稀释液灌胃(每日10mL/kg)，三甲益肝冲剂组造模同时给予三甲益肝冲剂蒸馏水稀释液灌胃(每日10mL/kg)，正常对照组腹腔注射生理盐水，用自来水灌胃，方法剂量同上，共4周。在造模过程中模型组死亡1只。

　　1.3 标本留取

　　实验4周后，氯氨酮麻醉下，将动物取仰位固定于手术台上，取左侧第3-4肋间逐层切开暴露胸腔，寻找下腔静脉，并抽血约4mL，离心获取血清待检;处死动物后，立即打开腹腔取肝组织，切成0.5cm×0.5cm×0.5cm大小的肝组织块，置于100mL/L中性福尔马林固定待用。

　　1.4 血清SOD活性和MDA含量的测定

　　将采集的血清，分别按试剂盒说明书进行。

　　1.5 肝组织病理观察

　　常规制作HE 切片及Masson染色，利用病理图像分析仪，定量分析Masson染色胶原，首先设定窗口面积，每组至少选8个视野，测定窗口范围内的胶原面积。

　　1.6 统计学处理

　　应用SPSS 12.0统计软件，计量资料正态分布用±s表示，行t检验。非正态分布用中位数M(Q)表示，组间采用Mannwhitney Test比较。相关分析采用Spearman等级相关分析，P<0.05表示差异有统计学意义。

　　2 结 果

　　2.1 病理形态学的观察结果

　　HE染色见模型组汇管区肝纤维增生且向肝小叶伸展，可见瘀胆、点状及融合性肝细胞坏死，肝索排列极度紊乱，肝窦扭曲充血,表明肝纤维化模型诱导成功。三甲益肝冲剂组和复方丹参组肝索均排列紊乱，肝细胞呈空泡样变性，可见较多的出血，汇管区扩大，纤维样物质增生较多且向肝小叶伸展(图1)。Masson胶原纤维染色可见正常大鼠仅在汇管区和中央静脉见少量胶原纤维，模型组可见较粗的纤维间隔;三甲益肝冲剂组和复方丹参组可见稍细的纤维间隔(图2)。各组肝组织Masson 染色胶原纤维面积比较见表1。

　　2.2 三甲益肝冲剂和复方丹参对大鼠血清MDA含量、SOD活性的影响

　　模型组血清MDA 含量显著增高，血清SOD活性显著降低，而三甲益肝冲剂和复方丹参组血清MDA含量明显低于模型组，血清SOD 活性较模型组明显增强(表1)。表1 各组大鼠肝组织Masson染色胶原纤维面积和血清MDA含量、SOD活性的比较(略)

　　2.3 肝组织Masson染色胶原纤维面积与血清MDA含量、SOD活性的相关性分析

　　肝组织Masson染色胶原纤维面积与血清MDA含量呈正相关(r=0.435, P<0.05)，与SOD活性呈负相关(r=-0.358, P<0.05)。

　　3 讨论

　　肝纤维化是肝损伤持续存在、组织发生损伤修复反应中因ECM合成、降解与沉积不平衡而引起的病理过程，是慢性肝病重要的病理特征。HSCs是一种特殊类型的细胞，正常情况下静息状态的HSCs其合成胶原的功能受抑制。在炎症、损伤等刺激下，HSC从含有维生素A脂滴的静止状态转化为另一种“激活”的肌成纤维样细胞，完全激活的HSC不再含有维生素A，能够表达α平滑肌肌动蛋白(αSMA)，具有收缩性、炎症性、高增殖性，并能产生肝脏大部分ECM。HSCs活化是肝纤维化发生的细胞学基础，是各种病因肝纤维化发生的共同中心环节，活化的HSCs是合成ECM的主要细胞和基地[56]。因此，抑制HSCs的活化，减少其增殖和ECM的生成，在防治肝纤维化中有重要意义。

　　肝脏是机体物质代谢中枢，在正常代谢过程中，肝内存在着自由基反应，而且肝脏又是脂质过氧化物降解的主要场所。因此，肝脏发生病变、肝细胞受损时，必然导致自由基代谢紊乱。自由基除了能直接作用于各种信号分子，促使HSCs增殖与活化，诱导肝纤维化的发生外，还能攻击肝细胞的各种膜结构，引起脂质过氧化链式反应，使肝细胞损伤和坏死，最终导致肝纤维化的形成[7]。因此，脂质过氧化被认为是肝脏炎性损伤发展至肝纤维化的桥梁,而抗氧化剂治疗可预防(减轻)肝纤维化[8]。

　　DMN是一种肝细胞基因毒性化学物质，能显著刺激肝窦内HSCs活化，引起大鼠较为典型的肝窦毛细血管化与肝纤维化，病变呈进行性，一旦纤维化病理形成，即使去除诱因，病程依然进行，短期内不易恢复。研究表明，DMN可引起脂质过氧化，且和肝纤维化形成密切相关[9]。因此，本实验选择DMN来诱导大鼠肝纤维化模型，以观察三甲益肝冲剂对大鼠肝纤维化的作用及与抗脂质过氧化的关系。

　　MDA是自由基攻击生物膜中的多不饱和脂肪酸而引发的脂质过氧化作用的最终分解产物，其含量水平可反映机体内细胞脂质过氧化的程度[1011]。SOD是体内存在的一种抗氧化酶，它对机体的氧化与抗氧化平衡起着至关重要的作用。它能将氧自由基歧化为H2O2，进一步在CAT(过氧化氢酶)、GSTPx的催化下被清除，从而保护细胞免受损伤[12]。本实验联合检测血清MDA含量和SOD活性，能间接反映机体脂质过氧化反应对组织的损伤程度。

　　三甲益肝冲剂为中药复方制剂，组方包括穿山甲、鳖甲、龟板、牡蛎、莪术、桃仁、丹参、郁金、赤芍、黄芪、白术、柴胡、内金、大黄、金钱草十五味。现代药理证实其中丹参、黄芪、大黄、柴胡等对DMN所致的肝损伤有明显的保护作用，可抑制DMN肝细胞脂质过氧化，使脂质过氧化产物生成减少，具有良好的抗肝纤维化作用[13]。本研究显示，模型组大鼠血清中MDA含量、SOD活性与正常对照组比较，有显著性差异(P<0.05);三甲益肝冲剂组或复方丹参组与模型组比较，均能显著降低大鼠血清中MDA含量，升高SOD活性，有显著性差异(P<0.05);三甲益肝冲剂组与复方丹参组比较，没有显著性差异(P>0.05)。各组MDA在血清中表达的增强程度与病理上肝纤维化严重程度相平行，模型组MDA含量明显增加，说明脂质过氧化在实验性肝纤维化的发生、发展过程中可能起重要作用。三甲益肝冲剂组能显著增强大鼠模型血清SOD的活性、降低MDA的含量，表明抗脂质过氧化可能是该方抗肝纤维化的重要作用机理。这与该方的现代药理研究相符。实验结果表明，三甲益肝冲剂与复方丹参组在各项检测指标的比较中大体相当。这为临床上应用三甲益肝冲剂治疗肝纤维化提供了理论和实验依据。

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