大鼠空肠黏膜上皮细胞酪酪肽受体的分布与特性

　　作者：闫媛，董 蕾 作者单位：1. 西安交通大学医学院第二附属医院消化内科，陕西西安 710004;2. 西安市中心医院消化科，陕西西安 710004

　　【摘要】 目的 检测正常大鼠空肠黏膜酪酪肽(PYY)受体的分布并测定反映酪酪肽受体特性的基本参数，初步阐明酪酪肽的作用位点和作用特点。方法 用125I标记酪酪肽并对其进行受体放射分析，测得酪酪肽受体的平衡解离常数，最大结合容量及Hill系数。结果 正常大鼠空肠黏膜上皮细胞酪酪肽受体的平衡解离常数(Kd)为(386.69±129.95)pmol/L，最大结合容量(Bmax)为(303.21±116.85)fmol/mg蛋白;Hill系数为1。酪酪肽受体为高亲和力受体。结论 正常大鼠空肠黏膜上皮细胞有酪酪肽受体的分布，酪酪肽受体之间无正负协同效应;酪酪肽受体对PYY具有高亲和性;可能有PYY直接与空肠黏膜上皮酪酪肽受体结合而直接抑制空肠黏膜的分泌。

　　【关键词】 酪酪肽受体;酪酪肽;平衡解离常数;最大结合容量;胃肠激素

　　in rat jejunum epithelial cellYAN Yuan1,2, DONG Lei1

　　(1. Department of Gastroenterology, the Second Affiliated Hospital,

　　Medical School of Xian Jiaotong University, Xian 710004;

　　2. Department of Gastroenterology, Xian Central Hospital, Xian 710004, China)ABSTRACT: Objective To detect normal rat jejunum epithelial cells to learn about the distribution of peptide YY (PYY) receptor and measured two important parameters of PYY receptor so as to explore the target that PYY binds to and display its physiological function. Methods Receptor radioligand assay was conducted by using 125IPYY to detect normal rat jejunum epithelial cells. We also measured receptor dissociation constant (Kd), the affinity or the ability that the receptor could bind ligand; maximum binding capacity (Bmax), the concentration of binding site; and Hill coefficient. Results There were PYY receptors in normal rat jejunum epithelial cells. Dissociation constant (Kd) of PYY receptor was (386.69±129.95)pmol/L. Maximum binding capacity (Bmax) was (303.21±116.85) fmol/mg protein. Hill coefficient was 1. PYY receptor had high affinity. Conclusion There are distributions of PYY receptors in normal rat jejunum epithelial cells. Kd means that PYY receptor has high affinity. Bmax means that the number of receptors is limited and decides the characters of saturability. We think that PYY directly inhibits secretion by binding to PYY receptor in jejunum epithelial cells when PYY inhibiting jejunum secretion.

　　KEY WORDS: peptide YY (PYY) receptor; peptide YY (PYY); dissociation constant (Kd); maximum binding capacity (Bmax); gastrointestinal hormone

　　酪酪肽(peptide YY, PYY)是近年发现的一种胃肠激素，它与血管活性肠肽(vasoactive intestinal peptide, VIP)、胆囊收缩素(cholecystokinin, CCK)等胃肠激素一样属于肽类激素，是消化系统乃至整个机体的一种重要调节肽。PYY对消化道有多种重要的生物学效应，如抑制肠黏膜分泌、影响消化道运动、刺激肠上皮增生、抑制胃酸及胰腺外分泌、影响摄食行为等[1]。PYY的这些生物学效应是通过作用于酪酪肽受体，激发细胞内下游信号分子而实现的[2]。但是，该过程的具体作用机制目前还不清楚，可能涉及黏膜上皮细胞、肠神经系统及中枢神经系统。通过测定正常大鼠空肠黏膜上皮细胞酪酪肽受体的分布，受体的亲和力及分布密度，以了解PYY在消化道的作用位点、结合特征和作用方式，对阐明PYY的作用机制及在消化道复杂调节网络中的作用有一定的意义。通过对正常个体酪酪肽受体分布和特征的了解，以分辨一些疾病的发生是否由于受体分布区域、分布密度及信号转导异常引起的，对揭示疾病病因和病理生理机制提供帮助。

　　1 材料与方法

　　1.1 研究对象 选择成年雄性健康SpragueDawley大鼠10只，体重在235～300g之间。

　　1.2 主要试剂 125I–PYY(比活度2200ci/mmol)由美国PerkinElmer公司生产，PYY由美国Phoenixpeptide公司生产，杆菌肽购于美国Sigma公司。

　　1.3 制备大鼠空肠黏膜上皮细胞膜的标本 断头法处死健康成年雄性SD大鼠，迅速取出空肠，用4℃、0.24mol/L NaCl冲洗干净，翻转肠管，用0.34mol/L NaCl充盈结扎两端，使黏膜面充分暴露。置入离散液中持续振荡10min，弃去肠管，将剩余液体装入离心管。2000g离心5min，弃去上清液，保留沉淀。向沉淀中加入KrebRinger 磷酸缓冲液冲洗后，2000g离心5min，保留沉淀。重复冲洗1次。取沉淀置于匀浆管，低温高速匀化1min。将匀浆1500g离心20min，弃去沉淀，保留上清液。上清液20000g离心20min，弃去上清液，保留沉淀。向沉淀中加入60mmol/L HEPES缓冲液冲洗后，20000g离心20min，保留沉淀。沉淀即为空肠黏膜上皮细胞膜，立即保存于液氮罐中备用。以上所有操作均在冰上进行，保证整个操作过程均在4℃以下，以保持受体活性。所有液体均需要放在4℃冰箱预冷。

　　1.4 测定大鼠空肠黏膜上皮细胞膜蛋白的浓度 液氮罐中取出大鼠空肠黏膜上皮细胞膜，用HEPES缓冲液充分溶解，考马斯亮兰法测定大鼠空肠黏膜上皮细胞膜蛋白浓度，紫外分光光度计595nm处测量，获得A值。细胞膜蛋白浓度=(A测定管吸光值÷A标准管吸光值)×标准蛋白液浓度。

　　1.5 受体放射配基结合分析方法测定正常大鼠空肠黏膜的酪酪肽受体 设定反应管和对照管两组，每组设10个反应浓度。两组均加入已测定蛋白浓度的细胞膜液。反应管中将PYY按照由低到高浓度(1pmol/L～1μmol/L)依次加入，再加入0.05nmol/L 125IPYY;对照管中将PYY按照由低到高浓度(1pmol/L～1μmol/L)依次加入后，均再加入0.1μmol/LPYY(此步骤使酪酪肽受体被非标记配体完全占领，从而显现非特异性结合)，再加入0.05nmol/L 125I–PYY。充分混合，15℃温孵2h后，加入冰冷的HEPES缓冲液终止反应。20000g离心，弃去上清液，将沉淀进行γ计数。每次反应重复3次。空肠黏膜富含酶类物质，加入杆菌肽抑制酶类破坏受体。反应组为总结合，对照组为非特异结合。受体的特异结合=总结合-非特异结合。每个反应浓度点的总结合、非特异结合值均取3次重复实验的平均值。将得到的酪酪肽受体特异结合数值换算成特异结合百分率[specific binding (%)]做纵坐标，以非标记配体浓度的对数值(Log mol/L)做横坐标，应用Excel制图软件得到竞争抑制曲线。应用Cheng & Prussoff公式计算平衡解离常数，最大结合容量值。

　　1.6 统计学处理 采用SPSS11.5软件处理数据，进行相关性分析及直线回归分析。

　　2 结 果

　　2.1 空肠黏膜的上皮细胞膜酪酪肽受体的平均特异性结合率 非标记配体(PYY)浓度(mol/L)和非标记配体浓度的对数值(Log mol/L)及空肠黏膜上皮细胞膜酪酪肽受体的平均特异性结合率的变化(表1)。对非标记配体浓度对数值与酪酪肽受体的平均特异性结合率进行Kendall相关性分析，结果显示：P=0.000<0.05。提示具有显著相关性，即随着非标记配体浓度的逐渐增加，受体与标记配体的特异结合逐渐减少。表1 酪酪肽受体的平均特异性结合率的变化

　　2.2 不同配体浓度时酪酪肽受体的特异性结合率的变化 横坐标Log(mol/L)为逐渐增高的PYY浓度对数值，纵坐标为酪酪肽受体的特异性结合百分率。随着非标记配体(PYY)浓度的改变，正常大鼠空肠黏膜上皮细胞膜的酪酪肽受体的特异性结合率呈现逐渐下降的变化(图1)。

　　2.3 酪酪肽受体的Kd值和Bmax值 正常大鼠空肠黏膜上皮细胞膜酪酪肽受体的Kd值和Bmax值以±s表示。平衡解离常数(Kd)：(386.69±129.95)pmol/L (149.53～973.29pmol/L)。最大结合容量(Bmax)：(303.21±116.85)fmol/mg蛋白(102.19～823.66fmol/mg蛋白)。

　　2.4 Hill图的形成 以与酪酪肽受体结合的放射性配体(B)的对数值为横坐标，以B/(Bt-B)(Bt为总放射性配体的量)的对数值为纵坐标，作Hill图。图形呈现为一条斜行直线(图2)。对Log B与Log[B/(Bt-B)]进行相关性分析，结果显示P=0.000<0.01。提示：Log B与Log[B/(Bt-B)]具有显著的相关性。对Log B与Log[B/(Bt-B)]进行直线回归分析，回归系数b=1.06，t检验P=0.000<0.05，回归系数有意义。方差分析P=0.000<0.05，回归系数有意义。回归系数代表Hill系数，即Hill系数近似等于1。显示PYY与空肠黏膜上皮细胞酪酪肽受体的结合为1∶1关系，即在PYY与空肠黏膜的酪酪肽受体结合过程中是一分子酪酪肽受体只结合一分子PYY;同时酪酪肽受体之间不存在正、负协同效应。酪酪肽受体是简单单位点系统。

　　3 讨 论

　　在大鼠空肠黏膜上皮细胞有酪酪肽受体分布，显示空肠黏膜上皮细胞是酪酪肽作用的靶细胞。酪酪肽受体属于膜受体范畴，这与肽类激素受体为膜受体的理论相一致。该受体是与G蛋白偶联的跨膜受体[2]，其作用过程可能有cAMP、cGMP及NO的参与[3]。

　　受体与配体结合的量存在差异，它们有不同的受体动力学特征。受体需要的结合配体的分子数及是否存在正、负协同效应均由Hill系数来反映。Hill系数为1，提示酪酪肽受体分子与PYY分子是以1∶1结合，受体之间不存在正、负协同效应，属于简单单位点系统。受体与配体结合能力存在差异，Kd值与受体亲和力呈反向关系。受体高亲和力，Kd值一般波动于10-8～10-12mol/L之间[4]。本实验测得正常大鼠空肠黏膜上皮细胞酪酪肽受体的Kd值为(386.69±129.95) pmol/L(149.53～973.29pmol/L)，处于该范围为高亲和力。正常状态下血浆PYY浓度很低[5]。PYY能完成其生物调节作用与酪酪肽受体的高亲和力特点密不可分。反映受体分布密度的量化指标是Bmax，其与受体分布密度呈正向关系，决定了PYY与酪酪肽受体结合的可饱和性，酪酪肽受体数量有限性使PYY固有活性受到限制。这体现了细胞对外界环境变化的自我保护作用。

　　随着受体基础研究的不断深入，受体与疾病的关系逐渐被认识。由于受体或受体后信号转导通路中的成分异常，使信号转导发生障碍(过强或过弱)导致靶细胞功能及代谢障碍而引起疾病的现象越来越受到重视。其原因包括多种因素引起受体数量或亲和力的改变。 如果受体数量减少(Bmax值降低)或缺失可以导致靶细胞对特定激素的敏感性降低或完全丧失反应能力，引起个体对激素的抵抗征候表现。如果受体在靶细胞有过度表达(Bmax值升高)，受体的活性限制解除，成为持续激活状态，导致信号积累而引起疾病。当靶细胞由于某种原因引起受体与激素亲和力降低(Kd值升高)，也会使靶细胞和激素特异性结合减少，影响生物效应。通过测定获得了代表健康状态下空肠黏膜酪酪肽受体亲和力的平衡解离常数及代表酪酪肽受体密度的最大结合容量两个指标的参数值。可以此为参考，以病患为研究对象，综合运用上述方法，对一些疾病状态下的空肠黏膜组织进行测定和比较，探讨疾病发生是否是由于酪酪肽受体的亲和力或酪酪肽受体数量异常引起，以及疾病发生发展与受体的亲和力或受体数量变化的关系，进行疾病病因和病理变化的研究。

　　PYY可以强有效地抑制肠道黏膜水、电解质分泌[6]。在肠易激综合征(IBS)患者降结肠的PYY水平降低[78]，炎症性肠病(IBD)患者空肠、结肠的PYY水平降低均可引起患者的腹泻症状[9]。目前，关于PYY抑制肠道黏膜水、电解质分泌的机制尚不清楚，多认为是通过肠神经系统途径[10]。PYY与酪酪肽受体结合后可减少细胞内第二信使cAMP的生成[11]，而cAMP是刺激肠黏膜上皮细胞分泌的重要因素，如霍乱弧菌毒素、大肠杆菌毒素、前列腺素和VIP都是通过激活腺苷酸环化酶，提高细胞内cAMP浓度，从而促进水、离子的分泌[12]。本研究于空肠黏膜上皮细胞检测到酪酪肽受体分布。推测在酪酪肽抑制空肠黏膜分泌的过程中，可能有PYY直接与空肠黏膜的酪酪肽受体结合而减少cAMP的生成来直接抑制分泌，支持PYY的抗分泌过程中可能有部分PYY与黏膜上皮酪酪肽受体结合而直接抑制黏膜分泌。

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