幽门螺杆菌vacA及cagA基因型与胃疾病的关系

　　作者：张凤娟，江月萍，赵清喜 张凤娟(1982)，女，硕士研究生。 作者单位：青岛大学医学院附属医院消化内科，山东 青岛 266003

　　【摘要】 目的 探讨幽门螺杆菌(Hp)vacA、cagA基因型与胃疾病的关系。方法 选取105例胃疾病病人，包括慢性浅表性胃炎(CSG)45例，慢性萎缩性胃炎(CAG)48例，胃癌(GC)12例。于胃窦处取3块胃黏膜，分别进行快速尿素酶反应、 病理检查和聚合酶链反应(PCR)。提取胃黏膜基因组DNA，用6对引物检测 Hp vacA、cagA 基因的表达。结果 快速尿素酶反应、病理检查均阳性的标本57例，Hp的阳性率为54.2%(57/105)。Hp vacA s1/m2、s1/m1、s2/m1、s2/m2 的阳性率分别为 53%(30/57)、18%(10/57)、8%(5/57)、21%(12/57);Hp cagA的阳性率为89%(51/57)。vacA、cagA基因型在CSG、CAG 和GC之间差异无显著性(P>0.05)。结论 Hp菌株的优势基因亚型为Hp cagA、vacA s1/m2;Hp vacA、cagA基因与特定胃疾病间无显著相关性，不能预示Hp感染的临床结果

　　【关键词】 胃疾病;螺杆菌,幽门;胃黏膜;vacA基因;cagA基因;聚合酶链反应

　　RELATIONSHIP BETWEEN GENOTYPES OF HELICOBACTER PYLORI vacA AND cagA AND GASTRIC DISEASES

　　ZHANG FENGJUAN, JIANG YUEPING, ZHAO QINGXI

　　Department of Gastroenterology, The Affiliated Hospital of Qingdao University Medical College, Qingdao 266003, China) ;

　　[ABSTRACT] Objective To investigate the relationship between vacA and cagA genotypes of Helicobacter pylori (Hp) and gastric diseases. Methods This study consisted of 105 patients with various gastric diseases including chronic superficial gastritis (CSG, 45 cases), chronic atrophic gastritis (CAG, 48), and gastric cancer (GC, 12). Three pieces of antrum mucosa were obtained from each patient. Rapid urease test, histological examination and polymerase chain reaction (PCR) were carried out in the specimen. DNA was extracted from the specimen, and six pairs of primers were used to detect the gene expression of vacA and cagA. Results Fiftyseven patients showed positive results in rapid urease test and histological examination, in which, the positive rate of Hp infection was 54.2% (57/105). The positive expression rates of vacA s1/m2, s1/m1, s2/m1, s2/m2 were 53% (30/57), 18% (10/57), 8%(5/57) and 21% (12/57), respectively. The expression rate of cagA was 89% (51/57). There was no significant differences in the expression of vacA, cagA among CSG, CAG and GC groups (P>0.05). Conclusion CagA and vacA s1/m2 were the dominant genotypes of Helicobacter pylori. There was no significant association between Helicobacter pylori genotypes vacA and cagA and special gastric diseases. The vacA and cagA genotypes cannot be used for predicting clinical outcomes caused by Helicobacter pylori infection.

　　[KEY WORDS] stomach diseases; Helicobacter pylori; gastric mucosa; vacA gene; cagA gene; polymerase chain reaction

　　自1983 年WARREN与MASHALL从胃黏膜中分离出幽门螺杆菌(Hp)后，国内外学者对Hp感染与胃十二指肠疾病的关系从多方面做了大量的研究。Hp感染是慢性胃炎和消化性溃疡的病因之一，也是胃癌的危险因素[1]。Hp的空泡形成毒素(vacA)基因和细胞毒素相关(cagA)基因及其表达产物与Hp感染者的临床发病有着密切关系[2]。本研究采用聚合酶链反应(PCR)技术检测105例胃疾病病人Hp vacA、cagA基因亚型，以探讨Hp vacA、cagA基因亚型与胃疾病的关系。

　　1 对象和方法

　　1.1 研究对象

　　选择2008年6—12月在我科就诊，需胃镜检查的病人105例，包括慢性浅表性胃炎(CSG)45例，慢性萎缩性胃炎(CAG)48例，胃癌(GC)12例。其中男51例，女54例，年龄17～76岁。胃镜检查前1个月内没有服用过抗生素、质子泵抑制剂、H2受体拮抗剂、非甾体类消炎药等。于胃窦处取黏膜3块，1块进行快速尿素酶反应，1块送组织学病理检查(亚甲蓝染色)，1块进行 PCR检测。

　　1.2 模板制备

　　用 BioTeke DAN 提取试剂盒(北京)提取胃黏膜及可能 Hp基因组，严格按照试剂盒说明书操作，

　　2期张凤娟，江月萍，赵清喜. 幽门螺杆菌vacA及cagA基因型与胃疾病的关系99

　　避免样本之间交叉污染。基因组 DNA置-20 ℃保存备用。

　　1.3 PCR反应

　　扩增 Hp vacA、cagA基因亚型的引物序列同文献[35]，见表1。采用广州东盛生物有限公司提供的 2×PCR Taq Mix反应体系，总反应体积为为50 μL。用touchdown PCR方法扩增基因，自65 ℃至50 ℃每降3 ℃循环3次，最后1个温度循环15次。PCR反应94 ℃变性30 s;所有循环反应结束后，72 ℃延伸10 min。引物由上海生工生物工程技术有限公司合成。以长100 bp DNA ladder(广州东盛生物有限公司)为Marker，于20 g/L琼脂糖凝胶上电泳检测 PCR产物。 表1 PCR检测 Hp vacA、cagA亚型的引物扩增区域引物编号引物序列(略)

　　1.4 统计学处理

　　采用SPSS 15.0统计学软件进行数据处理，数据间比较采用χ2检验。

　　2 结 果

　　2.1 Hp阳性率

　　105例病人中，快速尿素酶反应阳性84例，组织学检查Hp阳性57例，两者均阳性的标本57例，Hp阳性率为54.2%(57/105)。

　　2.2 vacA基因型检测

　　Hp阳性病人 vacA s1/m2、s1/m1、s2/m1、s2/m2 的阳性率分别为 53%(30/57)、18%(10/57)、8%(5/57)、21%(12/57)，vacA s1/m2阳性率与其他基因亚型相比，差异有统计学意义(χ2=5.07，P<0.05)。vacA基因型在CSG、CAG 和GC之间差异无显著性(P>0.05)。见表2。

　　2.3 cagA基因型检测

　　Hp阳性病人中cagA阳性率为89%(51/57)，阴性率为11%(6/57)，二者比较差异有显著意义(χ2=13.40，P<0.05)。cagA基因型在CSG、CAG 和GC之间差异无显著性(P>0.05)。见表2。表2 vacA与cagA基因型与胃疾病的关系(略)

　　3 讨 论

　　目前已经确认Hp是慢性胃炎的主要致病因子，是消化性溃疡发病及复发的主要因素，也是胃癌的一个重要危险因子[6]，世界卫生组织在1994 年将其列为人类胃癌的Ⅰ类致癌原。中国既是胃癌高发国家之一,又是 Hp 高感染国家，其人群感染率为40%～70%,且随年龄增长而增高[7]。但有些地区Hp感染率高，而发病率并不高，所以，Hp感染后可造成多种不同结局,除宿主的遗传、免疫因素及其他环境因素共同起作用外,Hp菌株的差异可能是造成多种结局的重要因素。vacA和cagA 作为 Hp两种重要毒力因子越来越受到专家们的关注。vacA可导致上皮细胞空泡样变性、损伤、坏死。1995年ATHDRTON等研究发现，Hp vacA基因有 2个可变区域，为信号区(s)和中间区(m)，s有 s1和 s2亚型，s1亚型再分为 s1a、s1b及s1c亚型; m分为 m1、m2。Hp菌株存在地区差异性,上海和广州以 s1a/m2 型为主,西安地区则以 s1a/m1型为主[8]。本组感染的 Hp菌株主要为 s1/m2 型(53%),而且有部分菌株无法通过现有的序列类型分型,同样的结果也见于其他研究报告中。说明Hp基因序列类型并不局限于ATHERTON所确定的信号序列和中间序列类型,可能还存在其他型别。

　　本研究结果显示，vacA基因型以s1/m2为主(53%)。ATHERTON等[9]报道 vacA s1/m1型 Hp产生vacA活性显著高于s1/m2型，很多研究显示s1/m1与消化性溃疡和胃癌相关，s2/m2与慢性胃炎相关。但是本研究没有显示vacA基因型与临床疾病显著相关，与有关的研究结果相似[1011]。虽然cagA本身无细胞毒活性，但与vacA 的转录、折叠、运转功能等有关，cagA编码的细胞毒素蛋白可导致宿主出现严重的炎症反应。本组cagA阳性率为89%，与先前报道相似[10]。本文未显示cagA基因与临床结果有显著的相关性。Hp cagA、vacA s1/ 100　m2常同时检出，是优势基因亚型。在慢性浅表性胃炎→萎缩性胃炎→肠上皮化生→异型增生→胃癌这一癌变模式中, Hp可能起着先导作用, 是胃癌发生的启动因子[12]。

　　综上所述，Hp菌株存在明显的地区差异性，病人胃黏膜Hp分离株以表达cagA、vacAs1/m2基因亚型较多见，未发现Hp vacA、cagA基因与特定胃疾病间存在显著相关性，因此，不能预示Hp感染的临床结果。Hp感染与胃疾病发生有着密切关系，但vacA、cagA阳性Hp菌株的存在并不是导致不同临床结果的关键因素。是否在Hp菌株中尚存在着未被人们发现的更为重要的毒力因子需要作进一步深入的研究。鉴于Hp基因组的高度变异性及在不同国家、不同地区菌株的差别，要开展 Hp相关疾病的防治，以本地区菌株为基础开展研究很有必要。

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