醛固酮及螺内酯对肝星状细胞中TIMP-1和MMP-2mRNA表达的影响

　　作者：任莉，苌新明，王云，焦明丽，常远鸿 作者单位：西安交通大学医学院第一附属医院消化内科，陕西西安 710061

　　【摘要】 目的 观察醛固酮及螺内酯对活化的肝星状细胞(HSC-T6)作用后不同时间段MMP-2和TIMP-1mRNA的表达情况。方法 采用RT-PCR的方法测定HSC-T6中MMP-2、TIMP-1mRNA的表达。结果 活化的HSC可表达MMP-2及TIMP-1的mRNA。醛固酮组MMP-2、TIMP-1的mRNA在48、72 h表达均高于对照组，在作用24、48、72 h时MMP-2、TIMP-1的mRNA的表达随时间递增。而螺内酯组则相反。醛固酮加螺内酯组与单加醛固酮组相比MMP-2、TIMP-1的mRNA表达下降。结论 醛固酮可能通过促使MMP-2及TIMP-1mRNA的表达促纤维化，螺内酯可抑制这一作用。

　　【关键词】 肝星状细胞;金属蛋白酶(MMPs);金属蛋白酶抑制剂(TIMPs);醛固酮(ALD);螺内酯

　　The effect of aldosterone and spironolactone on the expression of　MMP-2 and TIMP-2 mRNA in hepatic stellate cells

　　Ren Li, Chang Xinming, Wang Yun, Jiao Mingli, Chang Yuanhong

　　Gastrointestinal Medicine, the First Affiliated Hospital, Medical School of　Xi’an Jiaotong University, Xi’an 710061, China

　　ABSTRACT: Objective To investigate the effect of aldosterone (ALD) and spironolactone on the expression of MMP-2 and TIMP-1 mRNA in hepatic stellate cells (HSC) at various time. Methods The expression of MMP-2 and TIMP-1 mRNA was measured by RT-PCR in HSC-T6. Results Activated HSC could express MMP-2 and TIMP-1 mRNA. The expression of MMP-2 and TIMP-1 mRNA increased at 48 h and 72 h in ALD group. At 24 h, 48 h and 72 h, MMP-2 and TIMP-1 mRNA expression increased with the passage of time. Comparing that in spironolactone plus ALD group with ALD group, the expression of MMP-2 and TIMP-1 mRNA decreased at 48 h and 72 h. Conclusion ALD can promote hepatic fibrosis by increasing the expression of MMP-2 and TIMP-1 mRNA, while spironolactone can inhabit the above-mentioned function of ALD.

　　KEY WORDS: hepatic stellate cells (HSC); matrix metalloproteinase (MMPs);tissue inhibitors of metalloproteinases (TIMPs); aldosterone (ALD); spironolactone

　　肝纤维化是慢性肝病发展的共同归宿，细胞外基质(extracellular matrix, ECM)的合成和降解不平衡是其形成的主要原因。其中肝星状细胞(hepatic stellate cells, HSC)的活化是纤维化发生的中心环节[1]。活化的HSC可大量生成Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型胶原、层黏蛋白(laminin, LN)、纤维连接蛋白(fibronectin, FN)、透明质酸(hyaluronic acid, HA)等多种ECM成分并合成金属蛋白酶(matrix metalloproteinase, MMPs)及金属蛋白酶抑制物(tissue inhibitors of metalloproteinases, TIMPs)以及多种细胞因子及炎症介质，促进纤维化发展[2]。MMPs和TIMPs在降解ECM中起着重要作用。近几年发现醛固酮(aldosterone, ALD)可致组织器官纤维化[3]，已证明ALD能在肝脏局部合成，并促进HSC合成胶原;动物实验表明ALD能增加一些促纤维化细胞因子的表达[4-7]，并能调节MMPs和TIMPs的活性[8-9]，这一作用可被其拮抗剂螺内酯拮抗[10]，但具体机制尚不清楚。本实验以HSC为研究对象，从基因水平探讨ALD和螺内酯对MMP-2及TIMP-1mRNA表达的影响。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　大鼠肝星状细胞株(HSC-T6)由第二军医大学张俊平教授馈赠。螺内酯、ALD、二甲基亚砜、DEPC(美国Sigma 公司);DMEM高糖培养基、胰蛋白酶、琼脂糖(美国Gibco 公司);新生牛血清(杭州赛乐生物工程有限公司);DNA Marker、2×PCR Taq Mix(广州东盛生物科技有限公司);Trizol Reagent(Invitrogen 公司);反转录试剂盒(Fermentas 公司);PCR引物由上海生工生物技术有限公司合成(表1)。表1 引物序列及长度(略)

　　1.2 方法

　　1.2.1 细胞培养及实验分组

　　HSC-T6传代后培养24 h，选约20%、40%、60%融合的细胞，用无血清培养基培养4 h后换为10 mL/L小牛血清的DMEM培养基并分组：对照组不含干预因素;醛固酮组含1×10-5mmol/L醛固酮;螺内酯组含1×10-6mmol/L螺内酯;醛固酮加螺内酯组含1×10-5mmol/L和1×10-6mmol/L的醛固酮和螺内酯，分别培养72、48、24 h。各组均设复孔三个。

　　1.2.2 用RT-PCR检测各组细胞中MMP-2及TIMP-1的RNA表达

　　按试剂盒说明提取细胞总RNA。用紫外分光光度仪测量总RNA的浓度和A260/280的比值;将提取的RNA在10 g/L琼脂糖凝胶上电泳(200 V，30 min)，检查18 S和28 S带的存在。cDNA的制备按反转录试剂盒说明进行。PCR反应体系：2×PCR Taq Mix(100 mmol/L KCl;20 mmol/L Tris-Cl;3 mmol/L MgCl2;0.2 g/L明胶)12.5 μL。Primer 1(10 μmol/L)1 μL，Primer 2(10 μmol/L)1 μL，cDNA模板1.0 μL，ddH2O加至总体积25 μL。分别按不同条件扩增目的基因片段。PCR产物在20 g/L的琼脂糖凝胶中电泳，以DNAMarker作为分子量标准，所得结果拍照并进行灰度值扫描。

　　1.2.3 统计学处理

　　行灰度值分析时，以目的条带与内参条带的吸光度比值(MMP-2/β-actin、TIMP-1/β-actin)代表目的基因mRNA相对水平。实验数据以±s表示，应用SPSS11.0统计分析软件，采用t′检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结 果

　　2.1 MMP-2和TIMP-1的mRNA在对照组各时间段的表达结果

　　MMP-2和TIMP-1的mRNA在对照组各时间段均有表达(表2-表3)。表2 各组24、48、72 h的MMP-2 mRNA表达(略)

　　2.2 各组MMP-2和TIMP-1的mRNA在作用48 h和72 h的表达

　　醛固酮组表达均高于对照组(P<0.05);且在72 h内，TIMP-1的mRNA的表达显著高于对照组(P<0.01)。螺内酯组的mRNA表达均低于对照组(P<0.05)。醛固酮加螺内酯组与单加醛固酮组相比mRNA的表达明显降低(P<0.05);但与对照组相比无统计学意义(表2-表3、图1-)。

　　2.3 各组MMP-2和TIMP-1的mRNA在作用24 h的表达结果及比较

　　醛固酮组及螺内酯组与对照组相比均无明显增高(P>0.05，表2-表3、图1-)。表3 各组24、48、72 h的TIMP-1 mRNA表达(略)

　　2.4 MMP-2和TIMP-1的mRNA在ALD作用不同时间的表达

　　随时间的延长，其mRNA的表达均持续增加(P<0.05)：72 h>48 h>24 h(表4、图1-)。表4 ALD组24、48、72 h MMP-2和TIMP-1的mRNA表达(略)

　　3 讨 论

　　明胶酶MMP-2主要参与基底膜Ⅳ型胶原的代谢，降解正常肝窦基底膜，破坏肝脏细胞生存的内环境，激活HSC，促进肝纤维化的发展。研究证明，在肝纤维化过程中，MMP-2在早中期明显升高，降解正常基底膜，促进ECM大量合成，晚期则明显降低，又由于MMP-1活力未相应提高，以致于间质胶原(尤其是Ⅰ型胶原)降解减少，ECM合成超过降解，导致胶原大量在组织中沉积[11]。Takahara[12]用Northern杂交法检测人纤维化肝脏中MMP-2比正常对照组高1.4倍。Hayasaka[13]在大鼠肝纤维化模型中发现MMP-2基因表达增加，酶图法显示活化的MMP-2在肝纤维化过程中增加了13-18倍，活化形式和总体之比在早期均升高，中期最高，硬化期下降。对原发性胆汁性肝硬化(primary biliary cirrhosis, PBC)和原发性硬化性胆管炎(primary sclerosing cholangitis, PSC)患者肝组织内检测发现MMP-2 mRNA较正常肝组织升高3-4倍[14]。

　　MMPs的抑制物TIMPs在肝脏中主要有TIMP-1和TIMP-2两种。TIMP-1可特异性地结合激活的MMP-1，从而抑制其对Ⅰ、Ⅲ型胶原的降解，使ECM沉积。已证明在肝纤维化的发生、发展过程中TIMP-1基因表达逐渐增强，肝硬化阶段达到高峰。Murawaki等研究示肝硬化患者肝组织内TIMP-1水平较正常升高41倍。Benyon则进一步在基因和蛋白水平证明肝纤维化时TIMP-1高于正常对照组。Muksina[15]发现慢性肝病患者肝脏内TIMP-1水平与门脉周围坏死、炎症、肝纤维化程度明显相关，肝组织内TIMP-1水平随肝纤维化的进展逐渐升高。

　　已发现ALD具有致器官纤维化的作用。目前发现ALD能促使肝脏中Ⅰ、Ⅳ型前胶原合成增加，还可增加明胶酶的活性;在心衰病人中MMPs与TIMPs比值改变及血浆MMP-9水平增加也得到证明[16]。Rombout[17]等用不同浓度的醛固酮作用于培养的肝星状细胞，以特异性免疫沉淀、磷显像法检测发现Ⅰ、Ⅳ型前胶原合成明显增加，认为醛固酮发挥其促肝纤维化作用与肝星状细胞有关。此外，有研究者发现醛固酮在早中期时促肝纤维化作用明显，而晚期时不明显。

　　螺内酯是醛固酮的竞争性拮抗剂，可通过拮抗ALD的作用抗纤维化。研究证实螺内酯能抑制多种致纤维化的细胞因子，降低胶原合成[18-21]，在肝脏能抑制HSC的增殖。本实验室张盈涛等[22]用CCl4制造肝纤维化大鼠模型，发现随着纤维化程度的加重，血清及肝组织中醛固酮水平不断上升，肝组织内胶原增生明显，转化生长因子β1(transforming growth factor-β1, TGF-β1)、血小板衍化生长因子(platelet derived growth factor, PDGF-BB)和α-平滑肌肌动蛋白(α-aortic smooth muscle, α-SMA)表达增强。与其相比，螺内酯预防组胶原面积减少，血清HA、Ⅲ型前胶原、Ⅳ型胶原及LN显著降低，TGF-β1、PDGF-BB和α-SMA表达减少。

　　HSC的活化及MMPs对ECM的降解在肝纤维化发展中起重要作用。本实验的研究对象采用与HSC的形态学及功能相似的HSC-T6永生化大鼠细胞株。本实验不同时间段对照组中HSC-T6中均有MMP-2及TIMP-1 mRNA表达。符合先前关于活化的HSC具有表达上述蛋白的作用的理论。在ALD干预组，48 h、72 h的MMP-2及TIMP-1的mRNA表达均高于对照组(P<0.05)，且在72 h时，TIMP-1的mRNA表达显著高于对照组(P<0.01)，这与其他研究者的结果一致。考虑ALD通过促使MMP-2的表达，发挥MMP-2激活HSC及降解正常基底膜的作用，致ECM大量沉积在组织中，促纤维化发展;同时，醛固酮明显增加HSC中TIMP-1的表达，表明其是通过上调TIMP-1，加强对MMP-13(MMP-13主要存在于大鼠中，人体内较多的是MMP-1)活性的抑制而减少降解Ⅰ、Ⅲ型胶原促纤维化。在各个时间段之间比较中还显示出：醛固酮对两种蛋白mRNA的促表达作用具有时间依赖性，随时间的延长表达增加。在螺内酯单独作用组MMP-2和TIMP-1的mRNA与各自对照组相比表达均下降(P<0.05)，进一步证明活化的HSC自身可分泌ALD，并通过结合胞浆和胞膜上的盐皮质激素受体，促进HSC合成MMP-2和TIMP-1，而螺内酯可拮抗ALD的这一作用。说明螺内酯抗纤维化的机制之一是以抑制MMP-2及TIMP-1的mRNA的表达实现的。以前的研究已经证明，螺内酯可降低TGF-β1、IL-1、PDGF等细胞因子，这些因子能增加TIMP-1表达，对MMP-2的表达作用尚存在争议，故考虑螺内酯对MMP-2及TIMP-1的mRNA表达的抑制作用与细胞因子有关，是间接作用的。对它是否能直接引起MMPs及TIMPs表达的变化还有待进一步研究。

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