5羟色胺受体可塑性在大鼠肠易激综合征中的作用

　　作者：徐俊荣，罗金燕，尚磊，孔武明 作者单位：西安交通大学医学院第二附属医院消化科，陕西西安 710004;中国人民解放军第四军医大学卫生统计学教研室，陕西西安 710033

　　【摘要】 目的 探讨5羟色胺(5-HT)以及5-HT3、5-HT4受体可塑性在肠易激综合征(IBS)不同亚型发病中的作用。方法 成年雄性SD大鼠27只，随机分为IBS合并腹泻组(IBS-D)、IBS合并便秘组(IBS-C)和空白对照组。分别采用乙酸灌肠、冰水灌胃的方法制备IBS-D和IBS-C大鼠模型。用5-HT以及5-HT3、5-HT4受体抗体的免疫组化方法检测各组大鼠肌间神经丛的5-HT及其受体数量的变化。结果 ①大鼠肌间神经丛5-HT阳性肠神经元数目IBS-D组(4.37±0.88)显著高于对照组(2.99±0.41，P<0.01)，而IBS-C组(3.04±0.35)和对照组相比无差异(P>0.05);②大鼠肌间神经丛5-HT3受体免疫组化染色的灰度值各组间差异无统计学意义(F=0.082, P=0.922);③大鼠肌间神经丛5-TH4受体免疫组化染色的灰度值IBS-D组(141.98±6.96)显著低于对照组(159.90±2.55，P<0.01)，而IBS-C组(155.62±2.03)与对照组差异无统计学意义(P>0.05)。结论 大鼠肠肌间神经元内的5-HT含量及5-HT4受体数量的显著增多可能与IBS-D大鼠的发病相关。

　　【关键词】 肠易激综合征;5-HT;5-HT3受体;5-HT4受体

　　Plasticity of 5-HT receptors in the IBS subgroups of experimental rats

　　Xu Junrong, Luo Jinyan, Shang Lei, Kong Wuming

　　1. Department of Gastroenterology, the Second Affiliated Hospital,Medical School of Xi’an Jiaotong University, Xi’an 710004; 2. Department of Health Statistics,Fourth Military Medical University, Xi’an 710033, China

　　ABSTRACT: Objective To investigate the effect of 5-hydroxytryptamine (5-HT) and the plasticity of 5-HT3 and 5-HT4 receptors in the myenteric plexus on the pathogenesis of irritable bowel syndrome (IBS) subgroups. Methods Twenty-seven male rats were randomly divided into three groups: IBS with diarrhea (IBS-D) group, IBS with constipation (IBS-C) group and blank control group. IBS-D model was made in rats by intracolonic instillation with acetic acid. IBS-C model was made in rats by gastric instillation with cool water. After rats in each group were killed, a colon segment was removed for detecting enteric neuron and excitatory neurotransmitter in the myenteric plexus using 5-HT and 5-HT3, 5-HT4 receptors immunohistochemistry method. Results ① The number of 5-HT positive neurons in the myenteric plexus of IBS-D group (4.37±0.88) group was significantly higher than that in control group (2.99±0.41, P<0.01). However, there was no significant difference between IBS-C group (3.04±0.35) and the control group (P>0.05). ② The results of the experiment showed that there was no difference in the number of 5-HT3 receptor positive neurons in the myenteric plexus among each group (F=0.082, P=0.922). ③ The positive value of 5-HT4 receptor immunoreactive neurons in the myenteric plexus of IBS-D group (141.98±6.96) group was significantly higher than that in control group (159.90±2.55) (P<0.01). But there was no significant difference between IBS-C group (155.62±2.03) and the control group (P>0.05). Conclusion Increased number of 5-HT and 5-HT4 receptor positive neurons in the myenteric plexus may be related to the pathogenesis of IBS-D rat model.

　　KEY WORDS: irritable bowel syndrome; 5- hydroxytryptamine (5-HT); 5-HT3 receptor; 5-HT4 receptor

　　肠易激综合征(irritable bowel syndrome, IBS)是最常见的一种胃肠道功能紊乱性疾病，是一类具有特殊病理生理基础的身心疾病。罗马Ⅲ标准主要依据粪便性状将IBS分为IBS合并便秘(IBS with constipation, IBS-C)、IBS合并腹泻(IBS with diarrhea, IBS-D)、混合型IBS(mixed IBS, IBS-M)和未分型IBS(unsubtyped IBS, IBS-U)四种亚型。5-HT是一种与胃肠道活动关系密切的脑肠肽。目前已知胃肠道存在五种5-HT受体，即5-HT1、5-HT2、5-HT3、5-HT4受体和5-HT7受体，这些受体除了对胃肠运动及分泌功能有影响外，对胃肠道感觉功能也有作用。大量研究显示，5-HT及其受体与IBS的发病有密切的关系。但肠肌间神经丛内5-HT及5-HT3、5-HT4受体在IBS-C、IBS-D两种亚型之间有无差异尚无报道，即5-HT及其受体的可塑性对于IBS不同亚型的发病有无影响尚不明确。本实验通过检测这两型大鼠肌间神经丛的5-HT阳性肠神经元及5-HT3、5-HT4受体数量的变化，探讨5-HT及其受体的可塑性与IBS发病的关系及其对IBS亚型的影响。

　　1 材料与方法

　　1.1 实验动物及试剂

　　成年雄性SD大鼠27只，体重220-250 g，由第四军医大学实验动物中心提供。5-HT多克隆抗体购自武汉博士德生物技术公司;兔抗大鼠5-HT3受体多克隆抗体、兔抗大鼠5-HT4受体多克隆抗体购自MBL公司;DAKO Evision系统购自DAKO 公司;SABC即用型试剂盒、DAB显色试剂盒购自武汉博士德生物技术公司。

　　1.2 实验方法

　　1.2.1 动物分组与实验处理

　　成年雄性SD大鼠27只，随机分为IBS-D组、IBS-C组和对照组共3组，每组9只大鼠。①IBS-D组：采用乙酸灌肠的方法制备IBS-D动物模型。实验第8天处死大鼠。②IBS-C组[1]：采用冰水每日灌胃共14 d的方法制备IBS-C动物模型。实验第15天处死大鼠。③空白对照组。各组大鼠处死后，取距肛门7 cm的结肠片段1 cm，在生理盐水中漂洗干净后，立即固定在10%(体积分数)甲醛溶液中，4 ℃保存。结肠标本经常规脱水、透明，石蜡包埋，Leitz 1512型超薄切片机上连续切片，片厚3-5 μm，用5-HT的免疫组化方法检测大鼠肠肌间神经丛内5-HT的含量。另外取距肛门7 cm的结肠片段3 cm，制备出肠肌间神经丛的铺片，用5-HT3受体和5-HT4受体的免疫组化方法检测大鼠肠肌间神经丛的5-HT3受体和5-HT4受体含量的变化。

　　1.2.2 肠肌间神经丛内5-HT含量的检测

　　采用免疫组化ABC法，步骤如下：石蜡切片常规脱蜡至水;3 mol/L的脲素中浸泡30 min;移入3%(体积分数)双氧水中孵育10 min;用微波炉热修复抗原; 加入5%(体积分数)马血清室温30 min;加入1∶100稀释的兔抗大鼠5-HT多克隆抗体4 ℃冰箱内孵育过夜，次日在37 ℃复温90 min;0.01 mol/L PBS冲洗3次;加入DAKO Evision系统37 ℃ 40 min;0.01 mol/L PBS冲洗3次;DAB显色5 min，终止反应，苏木素轻度复染，脱水透明，显微镜下观察结果。其中一抗和二抗用含10 mL/L马血清和3 g/L Triton-X100的0.01 mol/L的PBS稀释，阴性对照实验用PBS替代5-HT抗体作为一抗进行孵育，采用人脑组织的病理切片作为阳性对照。病理切片在Olympus CHB显微镜下连续观察10个高倍视野(10×40，约5 mm的标本长度)，计数肠肌间神经丛内5-HT阳性的肠神经元的数量，计算出平均每mm的阳性神经元数量。

　　1.2.3 肠肌间神经丛5-HT3受体含量的检测

　　①肠肌间神经丛铺片的制备：处死大鼠后，取新鲜远端结肠肠管3 cm，用0.01 mol/L PBS冲洗后用40 g/L多聚甲醛液充盈，将肠管两端结扎紧，立即用40 g/L多聚甲醛液固定3 h，再移至250 g/L蔗糖4 ℃过夜。次日沿肠系膜处剪开肠管，再将组织剪成0.5 cm×0.5 cm的组织块，在解剖显微镜下用钟表镊剥除黏膜层和黏膜下层，再用镊尖轻轻挑去附于肌间神经丛的环行肌，即得位于环行肌和纵行肌之间的肌间神经丛。②免疫组化染色：肠肌间神经丛铺片用0.01 mol/L PBS(pH 7.4)冲洗3次;移入80%(体积分数)甲醇双氧水中孵育10 min;加入5%(体积分数)马血清室温30 min;加入1∶50稀释的兔抗大鼠5-HT3多克隆抗体室温下轻摇3 h，再转入4 ℃冰箱内孵育48 h，37 ℃孵育箱中复温90 min;0.01 mol/L PBS冲洗3次;加入DAKO Evision系统室温下轻摇3 h;0.01 mol/L PBS冲洗3次;DAB显色15-20 min，终止反应，脱水透明，封片后显微镜下观察结果。其中一抗用含10 mL/L马血清和3 mL/L Triton-X100的0.01 mol/L的PBS(pH 7.4)稀释，阴性对照实验用PBS替代5-HT3抗体作为一抗进行孵育。采用Aristoplan Q570C图像分析仪，每个标本随机选取5个高倍视野测定免疫组化染色阳性部位的灰度值，计算平均值。

　　1.2.4 肠肌间神经丛5-HT4受体含量的检测

　　方法同肠肌间神经丛5-HT3受体含量的检测。5-HT4受体的稀释比例为1∶80。图像分析同5-HT3。

　　1.3 统计学分析

　　使用SPSS11.0软件进行统计分析，多组间比较采用方差分析，组间多重比较采用LSD-t检验，以P<0.05认为差异有统计学意义。

　　2 结 果

　　2.1 大鼠肌间神经丛5-HT含量的检测结果

　　各组大鼠肌间神经丛5-HT阳性肠神经元数目差异有统计学意义(F=17.984，P<0.01)。IBS-D组大鼠肌间神经丛5-HT阳性肠神经元数目[(4.37±0.88)个/mm]显著高于对照组[(2.99±0.41)个/mm](P<0.01);IBS-C组[(3.04±0.35)个/mm]和对照组无差异(P>0.05，图1)。

　　2.2 大鼠肌间神经丛5-HT3、5-HT4受体含量的检测结果

　　各组大鼠肌间神经丛5-HT3受体免疫组化染色的灰度值无显著性差异(F=0.082，P=0.922，表2)。而5-HT4受体免疫组化染色的灰度值差异有统计学意义(F=40.108，P<0.01)。IBS-D组大鼠肌间神经丛内5-HT4受体免疫组化染色的灰度值显著低于对照组和IBS-C组(P<0.01)，而IBS-C组与对照组差异无统计学意义(P>0.05，表1、图2)。 表1 各组大鼠肌间神经丛5-HT3、5-HT4受体阳性的免疫组化染色的灰度值(略)

　　3 讨 论

　　IBS是一种常见的功能性胃肠道疾病。目前认为它是最能体现生物学和社会心理因素相互作用的一种疾病，其发病与胃肠道动力的改变、内脏痛觉过敏、脑肠相互作用的紊乱、感染等因素有关[2]。模拟人IBS的动物模型报道较多，但多为用大鼠模拟IBS-D，而IBS-C的动物模型报道较少，并且对IBS两型发病机制差异的研究未涉及肠肌间神经丛和黏膜下神经丛的改变。在以往的研究中，我们验证了冰水灌胃法造成的大鼠IBS-C动物模型、乙酸灌肠法造成的大鼠IBS-D动物模型的可靠性及其在研究中的可行性[1]，并对比研究了IBS-C和IBS-D两型大鼠模型肠肌间神经丛内肠神经元数量的变化，发现肠肌间神经丛内肠神经元数量的减少可能是IBS-D和IBS-C发病的共同机制[3]。本实验通过检测IBS两型大鼠肠肌间神经丛的5-HT阳性肠神经元及5-HT3、5-HT4受体阳性神经元数目的变化，进一步探讨肠肌间神经丛5-HT数量的差异及5-HT受体可塑性对于IBS发病及亚型的影响。

　　5-HT是一种广泛存在于中枢神经系统和胃肠道的神经递质，具有多种生物学功能。5-HT信号的改变可以直接导致IBS肠内和肠外症状[4]。许多研究表明IBS-D患者的5-HT释放增加。在以腹泻为主的IBS患者血清和乙状结肠黏膜内已观察到5-HT浓度显著高于对照组[5]。感染后IBS患者的肠嗜铬(Enterochromaffin, EC)细胞数量增加进一步提示5-HT在IBS中的作用[6]。学者们对于IBS不同亚型EC细胞及5-HT水平的差异也做了相关的研究。李兆申等[7]研究发现IBS-D、IBS-C患者结肠黏膜EC细胞数明显高于正常对照组,而两组患者之间无差异。但也有的研究结论与此相悖。Coates等[8]对溃疡性结肠炎、IBS-D、IBS-C患者的直肠活检标本进行检测, 观察到3组标本的黏膜5-HT水平、5-HT转运体免疫活性均明显降低, 在基础状态和机械刺激时, 3组患者EC细胞释放5-HT的量与对照组相比无明显差异。尽管已有不少关于5-HT和IBS不同亚型关系的研究，但都关注的是肠黏膜内及EC细胞储存的5-HT的含量，对于与调节胃肠道运动密切相关的肠肌间神经丛的神经元内5-HT含量的差异却未见报道。我们的研究发现，IBS-D组大鼠肌间神经丛5-HT阳性肠神经元细胞数目显著高于对照组(P<0.01)，而IBS-C组和对照组无差异(P>0.05)，说明肠肌间神经元内的5-HT含量在IBS不同亚型之间存在差异，肠肌间神经元内5-HT含量的增加可能通过影响肠神经元的功能从而导致IBS-D组大鼠大便性状的改变，而肠肌间神经元内的5-HT含量与IBS-C的发病无直接关系。

　　目前已知5-HT受体至少存在7种类型，与胃肠道功能密切相关的是5-HT1、5-HT2、5-HT3、5-HT4和5-HT7受体，其中5-HT3和5-HT4受体与胃肠道的感觉和运动功能最为密切。5-HT3受体是一种腺体门控阴离子通道，它是一种突触后受体，位于肠道的外在感觉神经元，向中枢神经系统传递伤害信号[9]。5-HT3受体表达于大多数的肠肌间神经元[10]，调控从5-HT能中间神经元发出的快兴奋性神经传递，与内脏敏感性的调节也密切相关[11]。5-HT4受体是一种G蛋白偶联亲代谢性受体，通过开放电压敏感性钙通道，激发其他在胃肠道运动和感觉方面起重要作用的神经递质的释放，从而影响胃肠道动力及内脏感觉[12]。与5-HT3受体不同的是，肠细胞膜上的5-HT4受体是突触前受体，黏膜下神经丛和肠肌间神经丛均有5-HT4受体表达[13]。Freeman 等[14]研究发现5-HT在肠黏膜的长期聚积会通过导致5-HT3受体的减少来影响胃肠道的分泌运动功能;另有学者研究发现血清素再摄取载体(serotonin reuptake transporter, SERT)基因敲除大鼠(SERT -/-)肠道内5-HT3B受体的表达量比SERT+/+大鼠少4倍[15]。这些研究结果说明在某些病理状态下肠神经系统存在5-HT受体可塑性的改变。尽管已知5-HT3受体及5-HT4受体的功能与IBS的发病密切相关，与它们相关的制剂已用于治疗IBS患者，但IBS不同亚型的肠肌间神经丛是否存在5-HT3受体及5-HT4受体数量的差异及其与IBS亚型的关系尚不知晓。我们的研究发现，各组大鼠之间肌间神经丛5-HT3受体免疫组化染色的灰度值无显著性差异，即5-HT3受体阳性的神经元数量在各组间无明显差异，也就是说IBS-C组和IBS-D组与对照组相比无5-HT3受体数量的改变。与5-HT3受体不同的是各组大鼠肌间神经丛5-HT4受体阳性的免疫组化染色的灰度值差异有统计学意义(F=40.108，P<0.01)。IBS-D组大鼠肌间神经丛内5-HT4受体免疫组化染色的灰度值显著低于对照组(P<0.01)，说明IBS-D组大鼠肌间神经丛内5-HT4受体显著多于对照组，而IBS-C组与对照组差异无统计学意义(P>0.05)。以往的研究发现，缺乏5-HT4受体的转基因小鼠结肠运动减慢，间接证明5-HT4受体有促进肠道运动的作用[11]。IBS-D组大鼠肌间神经丛内5-HT4受体数量的显著增多及5-HT含量的增加可能会导致大鼠肠道的过度运动，从而影响IBS-D大鼠大便的性状及内脏敏感性的改变。

　　综上所述，我们的研究结果表明肠肌间神经元内的5-HT含量及5-HT4受体数量的显著增多可能与IBS-D大鼠的发病相关;肠肌间神经元内的5-HT含量与IBS-C的发病无直接关系。

　　【参考文献】

　　[1]徐俊荣，罗金燕，尚 磊，等. 从肠肌间神经丛抑制性神经递质的改变探讨IBS不同亚型的发病机制 [J]. 世界华人消化杂志, 2005, 13(19):2332-2338.

　　[2]Longstreth GF, Thompson WG, Chey WD, et al. Functional bowel disorders [J]. Gastroenterology, 2006, 130(5):1480-1491.

　　[3]徐俊荣，罗金燕，尚 磊，等. 肠神经元及肠胶质细胞在肠易激综合征不同亚型中的意义及替加色罗干预的结果 [J]. 神经解剖学杂志, 2006, 22(6):643-647.

　　[4]Crowell MD. Role of serotonin in the pathophysiology of the irritable bowel syndrome [J]. Br J Pharmacol, 2004, 141(8):1285-1293.

　　[5]雷云霞, 蔡淦. 5羟色胺在肠易激综合征中的作用 [J]. 中国中西医结合消化杂志, 2005, 13(6):410-413.

　　[6]Dunlop SP, Jenkins D, Spiller RC. Distinctive clinical, psychological, and histological features of postinfective irritable bowel syndrome [J]. Am J Gastroenterol, 2003, 98(7):1578-1583.

　　[7]李兆申，詹丽杏，邹多武，等. 肠易激综合征患者分泌5 羟色胺的肠嗜铬细胞形态及功能改变 [J]. 中华消化杂志, 2004, 24(2):94-97.

　　[8]Coates MD, Mahoney CR, Linden DR, et al. Molecular defectes in mucoasal serotonin content and decreased serotonin reuptake transporter in ulcerative colitis and irritable bowel syndrome [J]. Gastroenterology, 2004, 126(7):1657-1664.

　　[9]Hicks GA, Coldwell JR, Schindler M, et al. Excitation of rat colonic afferent fibers by 5-HT3 receptors [J]. J Physiol, 2002, 544(3):861-869.

　　[10]Glatzle J, Sternini C, Robin C, et al. Expression of 5-HT3 receptors in the rat gastrointestinal tract [J]. Gastroenterology, 2002, 123(1):217-226.

　　[11]Gershon MD. Nerves, reflexes, and the enteric nervous system: pathogenesis of the irritable bowel syndrome [J]. J Clin Gastroenterol, 2005, 39(Suppl 3):S184-S193.

　　[12]李天津，余保平. 5-羟色胺3、4受体与胃肠运动及临床意义 [J]. 国外医学·消化系疾病分册, 2004, 24(6):354-357.

　　[13]Liu M, Geddis MS, Wen Y, et al. Expression and function of 5-HT4 receptors in the mouse enteric nervous system [J]. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol, 2005, 289(6):G1148-G1163.

　　[14]Freeman SL, Glatzle J, Robin CS, et al. Ligand-induced 5-HT3 receptor internalization in enteric neurons in rat ileum [J]. Gastroenterology, 2006, 131(1):97-107.

　　[15]Liu MT, Rayport S, Jiang Y, et al. Expression and function of 5-HT3 receptors in the enteric neurons of mice lacking the serotonin transporter [J]. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol, 2002, 283(6):G1398-G1411.