植物雌激素木黄酮对HSCT6细胞增殖及雌激素受体表达的影响

　　作者：许君望，任晓侠，王 云，史红阳，王艳燕 作者单位：西安交通大学医学院第一附属医院消化内科，陕西西安 710061

　　【摘要】 目的 研究植物雌激素木黄酮对体外培养的肝星状细胞(HSCT6)的增殖、活化、胶原合成以及对雌激素受体(ER)表达的影响，探讨木黄酮抑制肝纤维化的作用机制。方法 选择细胞系HSCT6为体外细胞模型，随机分为4组，分别加入不同浓度的木黄酮(0.5、5、50μmol/L)，同时设未加任何药物的空白对照组。作用24h后采用MTT法检测HSCT6细胞的增殖情况，放射免疫法测定细胞上清液Ⅲ型胶原(PCⅢ)、透明质酸(HA)的含量;免疫组化法观察木黄酮对各组HSCT6细胞α平滑肌肌动蛋白(αSMA)及ER表达的影响。结果 木黄酮各剂量组均不同程度地抑制HSCT6细胞的增殖，降低其αSMA的表达，减少PCⅢ及HA的分泌，且其抑制作用呈剂量依赖性;给予木黄酮后，HSCT6细胞的ER表达增强，也呈剂量效应关系。结论 木黄酮可抑制体外培养的HSCT6细胞的活化与增殖，减少细胞外基质的产生，抑制肝纤维化的形成。其作用机制可能与木黄酮增加HSC的ER表达有关。

　　【关键词】 肝纤维化;肝星状细胞(HSC);木黄酮;雌激素受体

　　(ER)expression of estrogen receptor of HSCT6 in vitroXU Junwang, REN Xiaoxia, WANG Yun, SHI Hongyang, WANG Yanyan

　　(Department of Gastroenterology, the First Affiliated Hospital,

　　Medical School of Xian Jiaotong University, Xian 710061, China)ABSTRACT: Objective To investigate the effects of phytoestrogen genistein on the proliferation, collagen synthesis, activation, and the expression of estrogen receptor (ER) in hepatic stellate cell (HSCT6) in vitro. Methods HSCT6 cells were randomly divided into genistein group (0.5μmol/L; 5μmol/L; 50μmol/L) and control group. All groups were simultaneously intervened in 24 hours. Cell proliferation was assessed by MTT colorimetric assay. Hyaluronic acid (HA) and procollagen Type Ⅲ (PCⅢ) were examined by radioimmunoassy (RIA). The expression of αsmooth muscle actin (αSMA) and ER of HSCT6 was detected by immunohistochemical method. Results The results showed that the three concentrations as 0.5, 5 and 50μmol/L of genistein could inhibit the proliferation of HSCT6, decrease PCⅢ, HA and lower expression of alphaSMA in a dosedependent manner. The expression of ER in each genistein group was increased compared to that in control group and also in a dosedependent manner. Conclusion Genistein has the effect of preventing hepatic fibrosis through inhibiting the proliferation, activation of HSC and collagen synthesis in HSC in vitro, the mechanism of which is partly due to its upregulation on ER level of HSCT6 cells.

　　KEY WORDS: hepatic fibrosis; hepatic stellate cell (HSC); genistein; estrogen receptor (ER)

　　研究发现，雌激素可以抑制多种原因所致的肝纤维化的形成，其潜在机制既有自身作为抗氧化剂的抗氧化作用及抗增殖、诱导细胞凋亡等作用，也可通过直接受体机制作用来抑制肝纤维化[13]。木黄酮(genistein)作为植物雌激素的一种主要成分，在结构上与雌二醇相似，具有雌激素的活性基团——二酚羟基[4]，因而具有类雌激素活性等多种生理活性。研究证实，木黄酮可以通过作用于血管平滑肌细胞上的雌激素受体(estrogen receptor, ER)而直接抑制大鼠动脉粥样硬化的形成[5]。由于纤维化疾病发病的相似性，推测木黄酮也可能通过同样的机制来对抗肝纤维化的形成。在本研究中，我们以体外培养的大鼠肝星状细胞系HSCT6为实验模型，观察木黄酮对肝星状细胞增殖、活化、胶原合成以及ER表达的影响。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　1.1.1 实验细胞 肝星状细胞系HSCT6由美国加利福尼亚旧金山总医院肝病研究中心Frideman教授、第二军医大学张俊平教授惠赠，系SV40转染的大鼠肝星状细胞，具有活化HSC的表型。

　　1.1.2 主要试剂 木黄酮冻干粉，美国Sigma公司;兔抗大鼠ER抗体，武汉博士德生物工程有限公司;小鼠抗大鼠α平滑肌肌动蛋白(αSMA)抗体，美国Neomaker公司;即用型SABC试剂盒、DAB显色试剂盒，武汉博士德生物工程有限公司;透明质酸(HA)、Ⅲ型胶原(PCⅢ)放射免疫试剂盒，上海海军医学研究所;四甲基偶氮唑盐(MTT)、二甲基亚砜(DMSO)，美国Sigma公司。

　　1.1.3 主要仪器 二氧化碳培养箱(Thermoforma);倒置相差生物显微镜(Olympus);酶标仪(biotekEL×800);高速离心机(Kendro, USA);免疫组化分析系统：Motic数码高清晰度彩色病理图像分析系统。

　　1.2 方法

　　1.2.1 木黄酮贮存液 木黄酮5mg以DMSO(370μL)溶解，制成50mmol/L的贮存液，4℃避光保存。使用前新鲜配制，用含50mL/L血清的DMEM(无酚红)培养液稀释至所需浓度。

　　1.2.2 细胞培养 HSCT6细胞于37℃快速复苏，用含100mL/L胎牛血清的DMEM培养液接种于50mL细胞培养瓶中，在37℃，50mL/L的CO2及饱和湿度下培养，隔天换液，每日于倒置显微镜下观察细胞形态和生长状况，待细胞生长至80%～90%密度时，给予传代。取生长状态良好的细胞用于实验。

　　1.2.3 细胞增殖实验 以MTT比色法检测HSC的增殖。取对数生长期的培养细胞HSCT6，用含100mL/L的胎牛血清DMEM(含酚红)培养液调整细胞密度至2×105个/mL,接种至培养板。培养细胞至生长融合后，加入木黄酮。以不同浓度木黄酮(0.5、5、50μmol/L)分组，同时设未加任何药物的空白对照组，每组重复数为6。作用24h后，每孔加5g/L的MTT贮存液20μL继续孵育4h后，弃上清并每孔加150μL DMSO溶解细胞内结晶，恒温震荡器震摇10min，酶标仪490nm波长测定各孔吸光度(A值)。

　　1.2.4 培养液HA、PCⅢ含量的检测 按上述方法处理分组后，24h后收集细胞培养基上清液，采用放射免疫法测定每一份样本的HA、PCⅢ含量。具体步骤按照试剂盒说明书进行，由专业人员操作。

　　1.2.5 HSCT6细胞αSMA和ER表达的检测 按上述方法处理，每孔内放入1片多聚赖氨酸处理过的盖玻片培养24h后，取出盖玻片，PBS冲洗、干燥，多聚甲醛固定。采用ElivisionTM plus法进行免疫组织化学染色。免疫组化标本经Motic数码高清晰度彩色病理图像分析系统进行图像分析。每张细胞片随机选取10个高倍视野(10×40)，每个视野内随机取20个细胞测定其灰度值，最终取10个高倍视野的阳性细胞平均灰度值作为该标本的αSMA或ER的平均表达强度，进行定量分析。

　　1.3 统计学分析 实验数据以±s表示，各组间差异用F检验，两两比较用q检验。全部数据经SPSS11.5统计软件分析，以双侧α=0.05为检验标准。

　　2 结 果

　　2.1 木黄酮对HSCT6细胞增殖的影响 结果显示，与空白对照组比较，木黄酮各剂量组均不同程度地抑制HSC细胞的增殖，以中剂量组和大剂量组更为明显，并呈一定的剂量相关性(表1)。表1 木黄酮对HSCT6细胞增殖的影响

　　2.2 木黄酮对HSCT6细胞分泌细胞外基质的影响 与空白对照组比较，木黄酮各组对HSCT6细胞分泌 PCⅢ及HA均有抑制作用，并随剂量的增加其抑制作用越明显，即呈剂量依赖性(表2)。

　　2.3 木黄酮对HSCT6细胞αSMA、ER表达的影响 免疫组化染色显示，αSMA多肽棕黄色颗粒表达在胞质，均匀染色;ER多肽棕色颗粒主要表达在胞质和胞核，以胞核为主，胞质染色稍淡。木黄酮各浓度组阳性细胞αSMA平均灰度值均低于正常对照组，而阳性细胞ER的平均灰度值却高于正常对照组，均以中剂量组和高剂量组明显。提示木黄酮可抑制HSCT6细胞的αSMA表达，而对HSCT6细胞ER的表达有明显的增强作用(表3)。表2 木黄酮对HSCT6细胞分泌细胞外基质的影响表3 木黄酮对HSCT6细胞αSMA、ER表达的影响

　　3 讨 论

　　肝纤维化是肝脏对各种慢性损伤的修复性应答反应。在肝纤维化的发生、发展过程中，肝星状细胞(HSC)起重要的核心作用。HSC在炎症、毒物及其他因素作用下由静止状态转为活化状态，激活后可转化为肌成纤维样细胞，获得增殖能力，表达平滑肌细胞骨架蛋白如αSMA，并能大量产生细胞外基质(ECM)，从而促进肝纤维化的形成。因此，抑制HSC的增殖与活化是防治肝纤维化的一种有效手段。

　　研究证实，内源性雌激素具有抗多种原因诱导的大鼠肝纤维化形成作用，这一作用可能是慢性肝病存在性别差异的原因之一[13]。并且发现外源性雌激素具有抑制肝纤维化形成的作用，可抑制HSC的活化、增殖，减少肝脏ECM的沉积，并呈一定的剂量相关性[6]。其抗纤维化机制可能与其抗自由基和抗脂质过氧化作用以及对肝组织一氧化氮(NO)、一氧化氮合酶(NOS)的调节有关;并可能通过调节一些细胞因子的作用，间接地发挥对肝纤维化的抑制作用;也可能直接通过影响肝脏中雌激素受体含量和基因的表达，抑制肝细胞的损伤及肝纤维化的进展[7]。因此，理论上雌激素有望成为有效预防和治疗肝纤维化的理想用药。然而，由于雌激素在机体内具有广泛的生物学效应，而肝脏并非是雌激素的主要靶器官，作为抗肝纤维化作用，其应用有诸多的副作用及局限性，如引起乳腺癌、子宫内膜癌的危险性升高和阴道出血的副作用等。因此，雌激素的长期应用价值受到限制。近年来，存在于植物中具有雌激素样作用的非甾体类化合物-植物雌激素，被认为更加安全而有望成为雌激素的替代品。

　　染料木黄酮为大豆异黄酮的主要活性成分，由于其结构与雌二醇相似，是一种具有弱雌激素作用的物质，属植物雌激素[4]。研究表明，大豆异黄酮对预防心血管疾病、骨质疏松、乳腺癌、前列腺癌以及调节生殖功能等具有明显的作用，并且对于动脉粥样硬化、肾脏纤维化有防治作用[89]。近年来研究发现，大豆异黄酮也能通过同样的作用机制来对抗肝纤维化的形成，可抑制已活化的HSC的增殖和转化，减少ECM的产生，抑制肝纤维化的形成[1011]。本研究显示，与空白对照组比较，不同剂量组的染料木黄酮均可不同程度地抑制HSCT6细胞的增殖，减少其αSMA的表达，并抑制HSCT6细胞分泌 PCⅢ及HA等ECM，以中剂量组和大剂量组更为明显，并呈一定的剂量相关性。表明植物雌激素木黄酮可抑制体外培养的HSC肝纤维化的形成。

　　一般认为，雌激素的受体作用途径是雌激素机体内发挥生物学效应的主要作用方式之一。雌激素的经典作用机制认为，雌激素首先与ER上的配体结合区结合并使受体二聚化，再与靶基因启动子上的雌激素应答元件结合从而启动靶基因的转录。植物雌激素木黄酮与天然的雌激素结构相似，均具有酚环结构，因此木黄酮可以与ER结合发挥雌激素效应。研究发现，植物雌激素异黄酮与ER结合后的潜在生物学效应表现为U型剂量效应关系，低剂量时，因其与雌激素竞争结合ER，主要表现为抗雌激素作用;中剂量时，可以产生一定的雌激素活性;高剂量时，补充的异黄酮可以活化因雌激素剂量不足未能活化的ER，产生雌激素增强效应。已有报道，人和动物的血管平滑肌细胞存在ERα和ERβ两种受体，植物雌激素木黄酮可以通过作用于血管平滑肌细胞的ER，直接抑制人和动物动脉粥样硬化的形成，发挥其对心血管系统的保护作用[4]。本研究显示，体外培养肝脏HSCT6细胞中存在ER，木黄酮可增加HSCT6细胞的ER表达，并呈剂量相关性，其增加程度与HSCT6细胞的增殖、αSMA表达及PCⅢ、HA等胶原沉积的减少程度相一致。我们知道，细胞对类固醇激素的反应性与其受体的含量有关。因此，本研究肝脏中HSCT6细胞ER表达的提高可能是木黄酮抑制肝纤维化形成的机制之一。表明木黄酮可能通过直接途径作用于HSC上的ER调节HSC的功能，从而发挥其抑制肝纤维化形成的作用。进一步的分子机制有待深入探讨。

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