低频噪音对大鼠胃组织一氧化氮合酶表达的影响

　　作者：王进海，郭晓燕，罗金燕，陈景藻 作者单位：1. 西安交通大学医学院第二附属医院消化内科，陕西西安 710004;2. 第四军医大学西京医院康复理疗科，陕西西安 710033

　　【摘要】 目的 探讨低频噪音(次声)对大鼠胃组织一氧化氮合酶表达的影响。方法 210只SD大鼠，其中140只随机分为8Hz90dB、8Hz130dB、16Hz130dB实验组及对照A组,按组别暴露于上述参数的次声舱中，2h/d;于次声作用1、7、14、21、28d随机取出7只检测其胃组织中诱导型一氧化氮合酶(iNOS)、内皮型一氧化氮合酶(eNOS)的表达。另外70只大鼠随机分为暴露组和对照B组，暴露组作用参数为8Hz130dB，2h/d，连续暴露14d;于停止次声作用后1、7、14、21、28d随机取出7只进行上述指标检查。结果 ①8Hz90dB次声作用14、21d，8Hz130dB次声作用7、14、21、28d，16Hz130dB次声作用7、14d，大鼠胃组织iNOS的表达均明显高于对照A组(P<0.05,P<0.01)，各组均以14d最为明显，且8Hz130dB组iNOS的表达明显高于其他实验组(P<0.05，P<0.01);②8Hz130dB次声作用14d停止暴露后胃组织iNOS表达阳性率逐渐下降，但仍高于对照B组(P<0.05, P<0.01);③上述参数的次声作用后胃组织eNOS表达与对照组比较差异无统计学意义。结论 ①不同频率和强度的低频噪音均可引起大鼠胃组织iNOS表达增加，其表达的水平与作用次声的频率、强度和作用时间有关;②大鼠对次声的多次作用可产生一定适应性，停止次声作用后，胃组织iNOS表达有自我恢复趋势;③同样参数的次声对胃组织eNOS的表达无明显影响。

　　【关键词】 次声;大鼠;胃组织;诱导型一氧化氮合酶;内皮型一氧化氮合酶

　　tissues of rats under exposure to infrasoundWANG Jinhai1, GUO Xiaoyan1, LUO Jinyan1, CHEN Jingzao2

　　(1. Department of Gastroenterology, the Second Affiliated Hospital, Medical School of

　　Xian Jiaotong University, Xian 710004; 2. Department of Physiotherapy,

　　Xijing Hospital, Fourth Military Medical University, Xian 710033, China)ABSTRACT: Objective To observe the effects of infrasound on the expression of inducible nitric oxide synthase (iNOS) and endothelial nitric oxide synthase (eNOS) in gastric tissues in rats. Methods The study consisted of a total of 210 SD rats. Of them, 140 rats were randomly divided into 8Hz90dB, 8Hz130dB and 16Hz130dB experimental groups and a control group A. The experimental groups were exposed to infrasound with different frequencies and intensities, 2h/d. After exposure for 1, 7, 14, 21 and 28 days, 7 rats randomly selected from each group underwent an examination of the expression of iNOS and eNOS in gastric tissues. The other 70 rats were randomly divided into a control group B and an exposure group continuously stimulated by infrasound with 8Hz130dB for 14 days, 2h/d, and after stopping exposure for 1, 7, 14, 21 and 28 days; the same indexes were detected in 7 rats randomly selected from each group. Results ① Compared with that in the control group A, the expression of iNOS in gastric tissues significantly increased in 8Hz90dB group after exposure for 14 and 21 days, in 8Hz130dB group after exposure for 7, 14, 21 and 28 days and in 16Hz130dB group after exposure for 7 and 14 days (P<0.05, P<0.01). The peaks in all groups were at 14th day, and the expression of iNOS in 8Hz130dB group significantly increased compared with that in the other two experimental groups (P<0.05, P<0.01). ② The expression of iNOS in gastric tissues tended to decrease when stopping 14 days Continuous exposure with 8Hz130dB, but it was still higher than that in control group B (P<0.05, P<0.01). ③ Compared with that in the control group, the expression of eNOS in gastric tissues was not significant after exposure with the same parametric infrasound. Conclusion ① The expression of iNOS in gastric tissues in rats was increased after exposure to infrasound with different frequencies and intensities and the level was closely related to the frequency, intensity and action time. ② Rats had adaptability to multiexposure to infrasound, and the expression of iNOS in gastric tissues tended to recover when the exposure was stopped. ③ The expression of eNOS in gastric tissues was not affected by infrasound under the same conditions.

　　KEY WORDS: infrasound; rat; gastric tissue; inducible nitric oxide synthase; endothelial nitric oxide synthase 次声广泛地存在于自然界、生产劳动及交通运输环境中，是目前国际上已公认的生产和生活噪声的重要组成部分。次声是频率范围在0.0001～20Hz的机械振动波,具有传播远、衰减少、穿透力强等物理学特性,由于其频率低于可听声频率的范围，所以一般不被人耳听到。我们已研究证实，一定声压和频率的次声可引起胃运动功能障碍和组织结构的损伤[12]，但是，目前还不清楚上述改变的分子生物学基础。一氧化氮(nitric oxide, NO)对胃肠道的作用具有双重性，生理范围内的NO对胃肠道黏膜具有重要保护功能，而过量的NO不但可引起胃肠黏膜的炎性损伤、黏膜的异常增生，也可引起胃肠运动功能的异常。一氧化氮合酶(nitric oxide synthase, NOS)是NO合成的关键限速酶，其表达直接影响NO的生成和NO的生理病理功能。因此，本研究观察不同频率和声压级水平的次声作用于大鼠后胃组织中诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase, iNOS)和内皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase, eNOS)的表达变化，探讨次声引起胃肠运动和形态学改变的分子生物学机制，拟为胃肠道疾病的防治提供新的理论依据。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　1.1.1 实验动物 一级雄性SpragueDawley大鼠210只，(6.4±0.5)周龄，体重(189±8.9)g，由第四军医大学实验动物中心提供，适应性喂养1周后进行实验。所有大鼠都在安静、室温20～24℃、自然光线条件下饲养。

　　1.1.2 主要实验仪器 次声声源和检查系统：采用第四军医大学研制的次声压力仓系统和检查系统。次声压力仓系统由低频信号发生器、功率放大器及电动扬声器组成;检查系统主要包括次声传声器和次声信号数据采集分析系统。阵列仪(Beecher Instruments MicroArray Technology，美国);组织处理机(Leica TP1050，德国);双筒显微镜及照相系统(BHZ型Olympus，日本)。

　　1.1.3 主要实验试剂 SP免疫组织化学染色试剂盒、兔抗鼠iNOS和eNOS多克隆抗体及eNOS和eNOS一抗多克隆抗体(Neomarkers公司);生物素标记的山羊抗兔、鼠IgG、封闭用正常山羊血清工作液及辣根酶标记链霉卵白素工作液(北京中杉桥生物有限公司);DAB和APES防脱片剂(武汉博士德生物工程有限公司);速眠新(保定安、氟哌啶醇等复方制剂，长春农牧大学兽医研究所)。

　　1.2 方法

　　1.2.1 次声暴露的方法 210只雄性SD大鼠，其中140只随机分成对照A组、8Hz90dB组、8Hz130dB组及16Hz130dB组4组，每组35只。实验组动物于每天上午8∶30～10∶30置于次声舱中，按分组次声的频率和强度每天暴露2h;对照A组动物每天于相同时间置于次声舱中2h，但无次声作用。每组分别于1、7、14、21、28d后随机取出7只进行组织学准备。另外70只大鼠随机分为暴露组和对照B组，每组35只。暴露组动物于上午8∶30～10∶30置于次声舱中，给予8Hz130dB的次声作用，2h/d，连续暴露14d后停止，分别于停止作用后1、7、14、21、28d随机取出7只进行胃组织学准备;对照组B每天于相同时间点置于次声舱中2h，不进行次声作用，余同暴露组。

　　1.2.2 胃组织学的准备 大鼠于最后1次次声作用完后1h内，用速眠新0.5mL/kg体重肌肉注射麻醉，迅速剖腹取胃，在装有Kerbs液的烧杯内清洗后，取胃组织(距幽门上0.5cm)一块，置于40g/L多聚甲醛磷酸缓冲液中固定24h，常规脱水、石蜡包埋。

　　1.2.3 阵列的设计 本研究共210只大鼠，取210个标本，制作成3个阵列，每个阵列点样为70个。故实验设计点阵排列为7×10(70个点样)，点样直径1.5mm。

　　1.2.4 组织芯片的制作 包括受体蜡块的制作、目标组织定位、选定组织的挖取、挖取组织植于受体蜡块中及微阵列蜡块的切片(厚度为4μm)等，裱片后将其贴在涂有APES切片黏合剂的载玻片上，凉干，60℃中烤片3min，58℃继续烤片18h，-20℃保存备用。

　　1.2.5 免疫组织化学染色 常规脱蜡水化，微波修复抗原;封闭内源性过氧化物酶;滴加正常兔血清封闭液，滴加一抗;滴加生物素标记羊抗兔二抗工作液;滴加HRP标记的链霉卵白素工作液，DAB显色;充分水洗、滴苏木素复染;分化后充分水洗返蓝;常规脱水透明，中性树胶封片。实验中以睾丸母细胞瘤标本作为阳性对照，用PBS缓冲液分别代替一抗和二抗作为阴性对照。

　　1.2.6 结果判定 采用双盲法阅片，由两位不同的观察者进行评价。对芯片的每一点样中每一观察区的细胞胞浆的染色结果根据染色强度进行评判：不着色为阴性(-)，着浅棕色为弱阳性(+)，着棕色为阳性()，着棕褐色为强阳性()，弱阳性+阳性+强阳性统计为总阳性数。由于NOS在胃壁分布不均，每一点样分3个观察区，即黏膜上皮区、黏膜下层区和肌层区。每一组7只大鼠，21个观察区(n)，分别统计每一观察区iNOS和eNOS的 染色强度的例数。

　　1.2.7 统计学处理 实验数据用百分率(%)或等级计数资料表示，采用SPSS11.0软件进行数据分析。组间百分率比较采用χ2检验或直接概率法检验，等级计数资料比较采用Ridit法检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结 果

　　2.1 次声作用对胃组织iNOS表达的影响

　　2.1.1 8Hz90dB次声对胃组织iNOS的影响 8Hz90dB组次声作用后14、21d胃组织iNOS的表达明显高于对照A组(P<0.05)，作用1、7、28d后胃组织iNOS的表达与对照A组比较无统计学意义(表1)。表1 8Hz90dB的次声作用对胃组织iNOS表达的影响

　　2.1.2 8Hz130dB的次声作用对胃组织iNOS表达的影响 8Hz130dB的次声作用后1d胃组织iNOS的表达与对照A组比较无统计学意义，但7、14、21、28d则明显高于对照A组(P<0.05，P<0.01，表2)。8Hz130dB次声作用后1、7、14、21、28d胃组织iNOS的表达见图1。表2 8Hz130dB的次声作用对胃组织iNOS表达的影响

　　2.1.3 16Hz130dB次声作用对胃组织iNOS表达的影响 16Hz130dB的次声作用后7、14d胃组织iNOS的表达明显高于对照A组(P<0.05)，而作用后1、21、28d与对照组比较则无统计学意义(表3)。表3 16Hz130dB的次声作用对胃组织iNOS表达的影响

　　2.1.4 8Hz130dB的次声作用2周停止暴露后胃组织iNOS表达的变化 8Hz130dB的次声作用2周停止暴露后1、7、14、21、28d胃组织iNOS表达阳性率分别为100%、84.2%、52.4%、40.0%和38.1%，均高于对照B组的4.8%、5.0%、5.0%、5.3%和4.8%(P<0.05，P<0.01)。8Hz130dB次声作用2周停止暴露后胃组织iNOS的表达有恢复的趋势，但在观察的28d内，胃组织iNOS阳性表达率仍然高于对照B组(图2)。

　　2.1.5 相同频率(8Hz)不同强度次声对胃组织iNOS表达的影响 8Hz130dB次声作用1、7、14、21、28d后胃组织iNOS阳性表达率均高于8Hz90dB组，但经统计学处理，只有14d组有统计学意义(P<0.05，表4)。

　　2.1.6 相同强度不同频率的次声对胃组织iNOS表达的影响 8Hz130dB次声作用7、14、21、28d后胃组织iNOS阳性表达率均高于16Hz130dB组，但经统计学处理，只有14d组差异有统计学意义(P<0.01，表5)。表4 8Hz130dB与8Hz90dB次声对胃组织iNOS表达的影响表5 8Hz130dB与16Hz130dB次声对胃组织iNOS表达的影响

　　2.2 次声对胃组织eNOS表达的影响 eNOS在正常胃组织的阳性表达率为100%。8Hz90dB、8Hz130dB及16Hz130dB次声作用1、7、14、21、28d后胃组织eNOS表达与对照组A比较均无统计学意义。

　　3 讨 论

　　目前，认为次声主要通过生物共振的直接损伤和间接的应激反应影响机体的生理功能[35]。有研究者发现，15Hz以下的频率、135dB的次声作用于人体时，受试者出现乏力、恶心、呕吐及食欲减退等症状。暴露于16Hz、120dB次声中的大鼠，10min内出现胃黏膜血流量减少，10min后更为明显，20min后大鼠胃黏膜血流量减少19.1%。我们的研究也发现，8Hz90dB、8Hz130dB及16Hz130dB的次声作用一定时间可引起大鼠胃排空功能障碍和胃组织形态与细胞超微结构的损害[12]，但其作用的分子机制还不清楚。

　　NOS是NO合成中关键的限速酶，其分布和表达直接影响着NO的功能。NOS广泛分布于哺乳动物和人的胃肠道组织中，但不同的部位和层次中分布的密度不同[67]。目前，发现有两类3种NOS同工酶：一类是原生型一氧化氮合酶(cNOS)，包括钙离子依赖的神经元型一氧化氮合酶(nNOS)和eNOS;另一类是钙离子非依赖的因外界刺激由炎性细胞产生的iNOS。nNOS和eNOS呈基础性表达，需要有钙离子、钙调素和还原型辅酶Ⅱ的参与，合成的NO量少，且维持时间短，参与正常的机体免疫功能和神经信息传递，调节黏膜血流。iNOS需要有细胞因子或内毒素的诱导才能产生，它不依赖于钙离子、钙调素和还原型辅酶Ⅱ，催化合成的NO量多且持续时间长。NO对胃肠道有双重作用，如在基础状态下可起到一种抗炎症的作用，但NO的过度产成则加重这种炎症损伤。到目前为止，认为NO在胃肠道可能参与的生理病理功能有：①胃肠黏膜血流调节;②胃肠道分泌功能调节;③胃肠黏膜免疫防护屏障;④胃肠黏膜炎症;⑤胃肠动力调节;⑥与肿瘤的关系[811]。

　　目前，对于iNOS与急慢性胃黏膜损伤的关系研究较多。已证实水浸、冷刺激、盐酸、烧伤及幽门螺杆菌感染等与胃肠黏膜iNOS表达关系密切[1214]。但次声作用(物理应急)与胃肠黏膜iNOS表达关系的研究未见文献报道。本研究发现，8Hz130dB、8Hz90dB及16Hz130dB次声作用一定时间均可引起胃黏膜iNOS表达的增高，且次声对胃黏膜的作用与次声本身的物理学特性有关，即与作用次声的声压级水平(强度)、频率和作用时间有密切的关系。8Hz130dB的次声对胃窦黏膜的iNOS表达的影响明显强于8Hz、90dB的次声，提示次声对胃黏膜的生物学效应与次声的强度呈正相关;8Hz130dB的次声对胃黏膜iNOS表达影响强于16Hz130dB，提示次声对胃肠道的生物学效应不但与作用次声本身的频率有关外，而且与组织对次声的敏感性有很大关系。由于腹腔脏器的固有频率是6～9Hz [15] ，所以8Hz作用较16Hz次声更易引起生物共振，产生更强生物学作用。本研究还发现次声作用的时间与胃黏膜iNOS表达并非呈平行的线性关系，8Hz次声作用后21d，16Hz次声以14d最为显著，之后胃黏膜iNOS表达降低，提示大鼠对多次次声的作用有一定的适应性。这与许多的研究结果一致[1617]。这是因为次声作用于人体后，机体会发生一系列全身性代偿性反应，减轻次声对组织细胞的损伤，以保护自己。

　　次声对机体的作用是多样的。低强度的次声对机体有治疗作用，高强度的次声对机体有损伤效应;次声的损伤有些是可恢复的[18]，有些是不可恢复的[19];轻度的损伤多是一过性的，大部分是可逆的;严重的损伤多是弥漫性、多器官损伤，部分是不可逆的，有的甚至是致命的。本研究发现，8Hz130dB次声作用2周后，停止暴露，动态观察4周，发现胃组织iNOS的表达有恢复的趋势，但在观察时间内(28d)其损伤仍未恢复至正常。次声对胃黏膜iNOS的表达远期后效应有待较长时间的观察研究。另外，本研究还发现，8Hz130dB、8Hz90dB及16Hz130dB的次声作用28d对胃黏膜eNOS的表达无明显影响，进一步证实eNOS激活与体内环境，尤其是血流因素有关，而与炎性环境无关。

　　总之，低频噪音(次声)作用可引起胃黏膜iNOS表达的增加，且表达的高低与次声的频率、强度及作用时间有关;大鼠胃黏膜iNOS表达对次声的作用有一定的适应性，次声作用停止后大鼠胃窦黏膜iNOS表达有恢复趋势;次声对胃体粘膜eNOS的表达无明显影响。上述结论进一步证实和支持了我们以前的研究。其机制可能是：次声引起机械振动造成胃黏膜的损伤，损伤导致组织炎性细胞的浸润，炎性细胞产生iNOS，一旦iNOS被激活，可产生大量的NO，引起机体一系列病理生理改变[20]，可导致和进一步加重次声对胃组织结构和功能的影响。

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