丹参酮IIA对肝癌细胞血管内皮生长因子表达的影响

　　作者：符寒，和水祥，徐俊丽，赵 刚，王艳丽，任牡丹 作者单位：西安交通大学医学院第一附属医院消化内科，陕西西安 710061

　　【摘要】 目的 观察丹参酮IIA对人肝癌SMMC7721细胞的增殖抑制和凋亡诱导作用，及对血管内皮生长因子(VEGF)表达的影响，探讨其可能的抗肿瘤作用机制。方法 体外培养人肝癌SMMC7721细胞株，MTT比色法观察细胞增殖抑制情况;荧光显微镜检测细胞凋亡;免疫细胞化学法和ELISA法分别检测细胞及细胞培养液中VEGF的表达情况。结果 丹参酮IIA对肝癌细胞的生长有明显的抑制作用，并呈剂量依赖性，以0.5mg/L终质量浓度的抑制作用最明显，其48h的抑制率为72.5%，与未加药对照组相比差异具有统计学意义(P<0.01);荧光显微镜下经丹参酮IIA作用后的肝癌细胞可见凋亡小体形成;免疫细胞化学染色及ELISA法检测发现，丹参酮IIA作用组肝癌细胞VEGF表达和培养液中VEGF分泌量明显减少，与未加药对照组相比差异有统计学意义(P<0.01)。结论 丹参酮IIA可下调细胞VEGF的表达，这可能是其抗肿瘤作用的机制之一。

　　【关键词】 丹参酮IIA;血管内皮生长因子(VEGF);肝癌;增殖抑制;凋亡

　　expression in hepatocellular carcinoma cell line SMMC7721FU Han, HE Shuixiang, XU Junli, ZHAO Gang, WANG Yanli, REN Mudan

　　(Department of Gastroenterology, the First Affiliated Hospital,

　　Medical School of Xian Jiaotong University, Xian 710061, China)ABSTRACT: Objective To evaluate the effects of Tanshinone IIA in inhibiting the proliferation, inducing apoptosis and the expression of vascular endothelial growth factor (VEGF) on SMMC7721 cell and to investigate the possible antitumor mechanism of Tanshinone IIA. Methods The human hepatocellular carcinoma cell line SMMC7721 was cultured in vitro. The cell growth activity was evaluated by MTT assay. The apoptosis of SMMC7721 was studied through the fluorescence microscope. The expression of VEGF of SMMC7721 cell and the cell culture fluid was determined by immunocytochemistry and ELISA assay, respectively. Results Tanshinone IIA treatment of SMMC7721 cells resulted in a strong growth inhibition in a dosedependent manner. The peak value of inhibition rate (72.5%) reached at 0.5mg/L Tanshinone IIA for 48h, and there were significant differences compared to control group (P<0.01). The formation of apoptotic bodies of SMMC7721 cell was observed in Tanshinone IIAtreated group under the fluorescence microscope. The expression of VEGF in Tanshinone IIAtreated group was significantly lower than that in control group (P<0.01). The similar result could be observed in cell culture fluid with ELISA assay. Conclusion Tanshinone IIA can inhibit the proliferation and induce the apoptosis of SMMC7721, and these results may be related to the downregulation of VEGF.

　　KEY WORDS: Tanshinone IIA; vascular endothelial growth factor (VEGF); hepatocellular carcinoma; proliferation inhibition; apoptosis

　　晚期肝癌的临床表现在中医诊断中属于血瘀症，中医治则中多运用活血化瘀法。丹参是一种有效的活血化淤中药。丹参酮IIA是从丹参中提取的一种醇溶性成分，具有清除氧自由基、抗脂质过氧化的作用。近年来的研究表明，丹参酮IIA对多种肿瘤细胞具有直接杀伤作用，但其确切的作用机制尚不十分清楚[12]。肿瘤血管的生成是由一系列促血管生成因子引发和维持的病理性血管生成过程，肿瘤的生长和转移依赖新生血管的形成，并受血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)等诸多细胞因子调节[35]。在本研究中，我们观察了丹参酮IIA对人肝癌SMMC7721细胞的增殖抑制和凋亡诱导作用，及对VEGF表达的影响，探讨其可能的抗肿瘤作用机制。

　　1 材料与方法

　　1.1 细胞、试剂及仪器 人肝癌细胞株(SMMC7721)由西安交通大学医学院第一附属医院临床分子实验中心陈葳主任惠赠。丹参酮IIA为中国药物制品检定所提供的化学标准品，溶解于二甲基亚砜(DMSO，终质量浓度为0.2mL/L)，4℃冷藏备用。RPMI1640培养液、小牛血清购自GIBCO公司;四甲基偶氮唑蓝(MTT)购自美国Sigma公司，DMSO溶解，4℃冷藏备用;VEGF鼠抗人单克隆抗体(工作浓度为1∶80)及免疫细胞化学SABC试剂盒(即用型)均购自北京中山生物技术中心;Hoechst33342购自武汉博士德试剂公司;ELISA全套免疫试剂盒购自深圳晶美生物工程公司;酶标仪为Sigma公司产品;荧光显微镜为德国LEICA公司产品。

　　1.2 细胞培养及实验分组 SMMC7721肝癌细胞在含150mL/L小牛血清的RPMI1640培养基中37℃、50mL/L CO2条件下常规传代培养。传1代培养的SMMC7721肝癌细胞用含150mL/L小牛血清的RPMI1640制备为2×105个/mL细胞悬液，分组培养，加入不同质量浓度的丹参酮IIA及终浓度300μmol/L的尼美舒利(选择性环氧合酶2抑制剂)进行实验，并以加入等体积的培养液为未加药对照组。

　　1.3 MTT比色法观察细胞的增殖 细胞悬液接种于96 孔板，每孔200μL，生长24h后，随机分8组，每组6复孔。1到6组分别加入终质量浓度为0.05、0.1、0.5、1.0、5.0、10.0mg/L的丹参酮IIA，第7组加入尼美舒利，第8 组加入等体积的培养液。分别作用24、48、72h后每孔加入5g/L的MTT贮存液20μL继续孵育4h，弃上清并每孔加150μL的DMSO溶解细胞内结晶，酶标仪490nm波长处测定吸光度(A)值。抑制率=(对照孔A490-实验孔A490)/对照孔A490×100%。根据MTT检测结果选取最佳作用浓度的丹参酮IIA处理肝癌细胞进行后续部分实验。

　　1.4 Hoechst33342荧光染色 以胰蛋白酶消化对数生长期的SMMC7721细胞，制成单细胞悬液，接种在预先放置盖玻片的24孔板上(按2×105个/mL细胞数进行接种)。随机分3组，分别加入0.5mg/L丹参酮IIA、300μmol/L尼美舒利和等体积的培养液，继续培养。48h后，收集各作用组的细胞，用PBS先洗片一次，然后加入荧光染液5mg/L Hochest33342室温孵育15min，再用PBS洗片2次，在LEICA DM LB2荧光显微镜下观察。结果评判：细胞凋亡过程中细胞核染色质的形态学改变分为三期：Ⅰ期的细胞核呈波纹状(rippled)或呈折缝样(creased)，部分染色质出现浓缩状态;Ⅱa期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化;Ⅱb期的细胞核裂解为碎块，产生凋亡小体。

　　1.5 免疫细胞化学染色检测VEGF的表达 实验与分组同上。48h后取出预置的盖玻片，用PBS清洗，40g/L多聚甲醛溶液固定10min后取出自然干燥，-20℃冰箱保存。采用SABC法免疫细胞化学染色，光学显微镜观察。结果判断：全面观察每张切片，VEGF定位于细胞质，阳性细胞染色呈棕褐色或棕黄色。随机选择10个具有代表意义的高倍视野，每个视野计数100个细胞中的阳性细胞数，取平均数作为结果。其中无阳性细胞为(-)，阳性细胞数<25%为(+)，25%～55%为()，>55%为();染色阴性计0分，淡黄色计1分，棕黄色计2分，棕褐色计3分。两种积分相加，积分0～1分表示阴性(-)，积分2～3表示阳性(+)，积分4～5表示阳性()，积分6～7表示阳性()。+视为低表达，和视为高表达，计算阳性细胞百分比。

　　1.6 ELISA法检测培养液中VEGF的浓度 实验与分组同上。48h后留取培养悬液，1000r/min离心，取上清液分装入数个Eppendorf管备用，同时对相应各组细胞进行计数。严格按照试剂盒说明进行操作。用酶标仪在450nm波长处检测吸光度(A)值，Curve Expert专用软件分析并制定标准曲线，从而计算出样品中VEGF的浓度。

　　1.7 统计学处理 实验数据均输入SPSS11.5软件进行统计学处理。计量资料以均值±标准差(±s)表示，两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析;计数资料采用秩和检验。以α=0.05为显著性检验水准。

　　2 结 果

　　2.1 丹参酮IIA对肝癌细胞增殖的影响 肝癌细胞经梯度浓度丹参酮IIA作用后，细胞生长受到不同程度的抑制，且这一抑制作用表现出一定的浓度和时间依赖性(图1)。

　　2.2 细胞形态学的变化 荧光显微镜下可见，未加药对照组细胞膜完整，胞质丰富而饱满。0.5mg/L丹参酮IIA作用组肝癌细胞体积缩小，细胞器出现肿胀，细胞核固缩，染色质可见边集于核膜下，有的细胞内还可见凋亡小体形成，核膜消失或突起呈小泡样，核质浓缩、碎裂。300μmol/L尼美舒利作用组中，可见细胞内出现凋亡小体，即细胞膜皱缩，细胞核浓聚甚至破裂呈大小不等、形态各异的细胞碎片，呈现出典型的凋亡细胞形态特征。除此之外，有的细胞还出现细胞器肿胀、破坏，细胞核破裂等细胞坏死的征象。

　　图1 不同浓度、不同时间丹参酮IIA作用后SMMC7721细胞的抑制率

　　Fig.1 The inhibition rate of SMMC7721 cell after treated with Tanshinone IIA for different concentrations and different time2.3 肝癌细胞中VEGF的表达 VEGF蛋白主要定位于SMMC7721肝癌细胞质中，胞质显示棕黄色颗粒为阳性。未加药对照组中，阳性细胞数量多，染色深，可见深棕黄色颗粒(图2A)。0.5mg/L丹参酮IIA作用组及300μmol/L尼美舒利作用组中可见VEGF染色阳性细胞数明显减少，染色程度轻，呈浅黄色颗粒(图2B、2C)。间质细胞的染色差异性较大，不计入阳性细胞数。在未加药对照组的VEGF高表达率为80%，尼美舒利作用组中为41.2%，0.5mg/L丹参酮IIA组中为68.3%。经统计学检验，差异具有统计学意义(P<0.01，表1)。

　　2.4 细胞培养液中VEGF浓度的测定 0.5mg/L丹参酮IIA作用组及尼美舒利作用组中VEGF的质量浓度分别为(208.45±21.38)pg/mL和(243.86±14.28)pg/mL，明显低于未加药对照组的(312.32±18.65)pg/mL，差异均具有统计学意义(P<0.01);而0.5mg/L丹参酮IIA作用组与尼美舒利作用组相比，VEGF浓度差异无统计学意义。表1 VEGF在SMMC7721细胞中的表达

　　3 讨 论

　　肿瘤是一种细胞凋亡减少而增殖过速的疾病。如果能抑制肿瘤细胞的增殖并诱导其凋亡，肿瘤细胞就有可能停止生长。故诱导肿瘤细胞凋亡已成为一条很有希望的治疗肿瘤的新途径，它将比杀伤肿瘤细胞的传统治疗方法有更加明显的优越性。中药诱导肿瘤细胞凋亡具有毒副作用小和不易复发等优点，对其作用机制的研究已成为目前的热点[6]。

　　丹参酮IIA是丹参的单体有效成分之一。有研究表明，其通过杀伤肿瘤细胞、诱导其分化和凋亡等途径发挥抗癌活性。本研究用不同浓度的丹参酮 IIA作用人肝癌细胞SMMC7721后，结果显示其对肿瘤细胞具有较强的抑制作用，并且呈明显的剂量依赖关系。0.5mg/L丹参酮 IIA处理人肝癌细胞48h后，荧光显微镜下可见细胞体积缩小、核固缩、染色质边聚及凋亡小体形成等凋亡早中期形态学变化。这与袁淑兰等[6]的报道一致，更进一步证实丹参酮 IIA可抑制人肝癌细胞的增殖并诱导肿瘤细胞凋亡。

　　现代医学研究表明，肿瘤的生长与转移是一个多步骤的复杂过程，肿瘤血管的生成在此过程中发挥着重要的作用。目前有关肿瘤与血管生成之间的相互作用机制也逐渐得以明确[5]。VEGF在肿瘤的生长及发展过程中扮演着极为重要的角色，可诱导肿瘤血管形成来满足肿瘤细胞对氧气及其他营养物质的不断需要，在肿瘤组织中有较高表达[7]。VEGF不仅与原发性肝癌的肿瘤血管生成、增殖有关，还直接参与肿瘤的浸润、转移等病理过程[89]。VEGF通过内皮细胞上的特异性受体，作用于内皮细胞，促进内皮细胞移动，有利于血管生成;同时还有利于肿瘤细胞脱落进入血循环或向临近组织扩散，为肿瘤的浸润、转移创造条件。基于以上理论，通过抑制VEGF等促肿瘤血管生成因子的表达，从而破坏肿瘤新生血管，阻断肿瘤血供，导致肿瘤细胞凋亡、坏死和阻断其转移，可能成为包括原发性肝细胞肝癌在内的肿瘤治疗方面的新策论[8]。本研究结果表明，VEGF在0.5mg/L丹参酮IIA处理组肝癌细胞中的高表达率仅为68.3%，明显低于未加药对照组的80%(P<0.01);0.5mg/L丹参酮IIA处理组细胞培养液中VEGF浓度也低于未加药对照组(P<0.01)。这提示丹参酮IIA可能通过下调肝癌细胞VEGF的表达及分泌，从而达到抑制肿瘤细胞增殖及诱导凋亡的作用。

　　近年来国内外众多研究表明，环氧合酶2(cyclooxygenase2, COX2)与VEGF在肿瘤细胞中的表达有很强的相关性。COX2过度表达，导致促血管生长因子的大量产生，而选择性COX2抑制剂可明显抑制促血管生长因子的表达[1012]。尼美舒利是一种有效的选择性COX2抑制剂，已证实不同剂量的尼美舒利作用于SMMC7721肝癌细胞系，呈现出时间和剂量依赖性的癌细胞生长抑制作用，凋亡率和凋亡指数也呈剂量依赖性增加[13]。本研究我们也观察到丹参酮IIA抑制VEGF表达的效果与选择性COX2抑制剂尼美舒利相当(P>0.05)。因此，我们推测丹参酮IIA也有可能通过COX2途径间接下调VEGF的表达从而实现抗肿瘤作用。但有关COX2与VEGF在丹参酮IIA抗肿瘤过程中的确切作用及其相互关系仍有待进一步的实验研究。

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