闭合型双循环生物人工肝支持系统治疗犬急性肝功能衰竭实验研究

闭合型双循环生物人工肝支持系统治疗犬急性肝功能衰竭实验研究作者：余德才 仇毓东 徐庆祥 丁义涛    作者单位：210008 南京大学医学院附属鼓楼医院肝胆外科、南京大学肝胆研究所    【摘要】  目的 探讨和评价闭合型双循环生物人工肝支持系统(CBCBALSS)在治疗犬急性肝功能衰竭模型过程中的稳定性、安全性和有效性。方法 建立犬急性肝功能衰竭模型(门腔分流联合胆总管离断)，采用CBCBALSS进行支持治疗。20只模型犬分为两组：CBCBALSS治疗组(n=11)；无肝细胞CBCBALSS对照组(n=9)。治疗时限6 h。检测实验犬血氨、生化全套、凝血因子(Factor Ⅶ)、支/芳氨基酸(BCAA/AAA)、单乙基甘氨酸二甲苯胺(monoethylglycinexylidide,MEGX)和细胞循环路生化全套、肝细胞密度和数量。结果 CBCBALSS细胞回路细胞悬液总体积200 ml，肝细胞的总数1×1010个、密度5×107/ml、活率98%左右。治疗中16只犬的生命体征平稳，在治疗30 min内均出现一过性低血压；2只转流开始15 min出现过敏反应；1只转流中因上消化道出血死亡；1只因穿刺部位出血死亡。模型治疗前血氨、ALT、TBil/DBil、白蛋白、Factor Ⅶ和BCAA/AAA分别达150 mmol/L、400 U/L、80/55 mmol/L、35 g/L、20%和1.6；CBCBALSS治疗6 h后，血氨、TBil/DBil下降均显著低于对照组；ALT存在下降趋势且在第6小时差异有统计学意义；白蛋白、Factor Ⅶ和BCAA/AAA在所有时段、组间差异均无统计学意义。在治疗1 h和2 h，MEGX差异有统计学意义，治疗组MEGX比对照组提前2 h达最高点。治疗15～30 min后，双循环路压力至115 mm Hg趋于平稳，且在±5 mm Hg波动。在治疗过程中，治疗组细胞循环路ALT显著性升高；组间细胞循环路TBil/DBil变化差异无统计学意义，而两组在各时间点均显著性升高；白蛋白变化无统计学意义。结论 CBCBALSS治疗犬急性肝功能衰竭过程中，安全、有效、稳定且代谢支持作用明显。    【关键词】  生物人工肝 急性肝功能衰竭 双循环 肝细胞 犬    Experimental study on closing bicirculating bioartificial liver support system for treatment of acute hepatic failure in canines  YU Decai, QIU Yudong, XU Qingxiang, DING Yitao. Department of Hepatobiliary Surgery, Institute of Hepatobiliary Surgery, Affiliated Drum Tower Hospital, School of Medicine, Nanjing University, Nanjing 210008, China    【Abstract】  Objective  To study and evaluate the stability, safety and efficacy of closing bicirculating bioartificial liver support system (CBCBALSS) in treatment of acute hepatic failure in canines. Methods  Twenty canine models with acute hepatic failure were set up through endside portocaval shunt with common bile duct transaction and then treated with CBCBALSS (treatment group, n=11) or no hepatocyte CBCBALSS (control group, n=9) for six hours. Serum ammonia, biochemical functions, factor Ⅶ, BCAA/AAA and monoethylglycinexylidide (MEGX) in serum of subjects and density, viability and number of hepatocytes in cell circulation were detected in treatment group. Results  The total volume of hepatocyte solution was 200 ml, with number, density and viability of hepatocyte for 1×1010, 5×107/ml and 98% respectively. During operation, stable clinical vital signs but transient hypotension within 30 minutes were seen in 16 canines including two with allergic reaction after 15 minutes (one per group), one death due to upper gastrointestinal hemorrhage and one death because of hemorrhage at puncture spot in CBCBALSS group. Before treatment, serum ammonia, ALT, total/direct bilirubin, factor Ⅶ and BCAA/AAA were 150 mmol/L, 400 U/L, 80/55 mmol/L, 35 g/L, 20% and 1.6, respectively. After treatment for six hours, serum ammonia and total/direct bilirubin decreased more significantly in treatment group than those in control group. ALT decreased significantly and showed statistical difference at the sixth hour. But there was no statistical difference in factor Ⅶ, BCAA/AAA and ALP between two groups at all time points. There was statistical difference in MEGX at the first and second hours, with climax of treatment group arrived earlier two hours. Bicirculating pressure was elevated to 115 mm Hg gradually, fluctuating at ±5 mm Hg. ALT increased significantly in treatment group. No statistical difference was found two groups upon Tbil/Dbil that increased at all time points. Changes of ALT had no statistical difference.Conclusion  ICBCBALSS is efficacious, safe and stable for treating acute hepatic failure in canines and exerts marked metabolic function.    【Key words】  Bioartificial liver; Acute hepatic failure;  Bicirculating;  Hepatocyte; Canines     当前,以肝细胞为基础的生物人工肝支持系统(bioartificial liver support system,BALSS)正日趋成熟。本实验建立门腔分流、胆总管离断的犬急性肝功能衰竭(acute hepatic failure,AHF)模型，并采用自行构建的闭合型双循环生物人工肝支持系统(closing bicirculating bioartificial liver support system, CBCBALSS)进行支持治疗，探讨和评价构建的CBCBALSS在治疗过程中的稳定性、安全性和有效性。1  材料与方法    1.1  实验材料    1.1.1  实验仪器和试剂    Bioliv A3A中空纤维管型生物反应器(香港德炬公司)；胶原酶Ⅳ(Collagenase Ⅳ)、RPMI1640(Gibco公司)；HGF、EGF、NGF(Sigma公司)；RPMI1640无血清培养基本实验室自行配制；Hanks液按文献［1］方法配制。    1.1.2  实验动物    中国实验用小型猪5头，体重3.1～4.5 kg，雌雄不限，购置于北京农业大学；杂种犬20只，体重10～25 kg,雌雄不限。    1.1.3  实验场所    南京大学生物化学系细胞室、南京大学医学院附属鼓楼医院清洁级动物实验室。    1.2  实验方法    1.2.1  分离猪肝细胞    采用改良两步原位胶原酶灌注法分离肝细胞［2］，制成密度为5×107/ml细胞悬液，培养于RPMI1640无血清培养基，置于37.5 ℃培养箱进行持续旋转培养(15 r/h)12 h，检测密度和活率没有显著性变化，用于CBCBALSS构建。    1.2.2  建立犬AHF模型［3］    在气管插管、静脉注射硫喷妥钠(10 mg/kg)和苯巴比妥(30 mg/kg)复合麻醉下，行门腔分流+胆总管离断术，常规肝功能衰竭内科对症处理，饲养至ALT>300 U/ml和TBil>68 mmol/L，行CBCBALSS治疗。    1.2.3  分组    CBCBALSS治疗组11只；无肝细胞CBCBALSS对照组9只。    1.2.4  构建CBCBALSS［1］    按图1安装管道；生物反应器纤维管内(血液循环路)采用肝素钠生理盐水(肝素钠12 500 u/500 ml生理盐水)冲洗、抗凝和排气，接双腔穿刺管；治疗组于细胞循环路注入200 ml猪肝细胞悬液(总量为1×1010个、密度为5×107/ml)，建立密闭的细胞循环路；对照组注入200 ml肝细胞培养液。生物反应器的外环境保持恒温(37.5 ℃)。    1.2.5  治疗药物  转流前肝素首剂静推50 U/kg,治疗中20 U/min维持，致犬全身肝素化；转流开始快速补液250 ml/15 min,转流中维持100 ml/h；转流结束后，予鱼精蛋白50 U/kg，细胞循环路注入利多卡因1 mg/kg。    1.2.6  观察指标    犬生命体征、有无过敏反应和双循环路压力变化；检测犬的血氨、生化全套、Factor Ⅶ、BCAA/AAA和单乙基甘氨酸二甲苯胺(monoethylglycinexylidide,MEGX)，细胞循环路生化全套、肝细胞密度和数量。    1.3  统计学处理    采用t检验方法进行数据分析(组间和组内比较)。图1  体外组合型生物人工肝循环辅助系统示意图2  结果    2.1  治疗后犬的临床结果    16只犬生命体征平稳，无过敏反应。治疗开始30 min左右，均出现一过性低血压，经快速补液，生命体征平稳，无不良反应。2只(每组各1只)转流15 min时腹部皮肤出现红色丘疹、呼吸急促和低血压等过敏症状，停止治疗并予地塞米松10 mg静脉推注，生命体征恢复平稳，交换治疗方式出现同样的反应，放弃继续实验。治疗组1只转流中出现上消化道出血、低血压，停止治疗后2 h死亡；1只出现持续低血压，停止治疗，抢救无效死亡。尸检显示：穿刺部位(腹股沟部)大面积血肿和渗血至腹膜后间隙。因此，两组各有8只模型犬列入循环实验，进行对比分析。    2.2  双循环路压力    治疗15～30 min后， 双循环路压力至115 mm Hg(1 mm Hg=0.133 kPa)趋于平稳，治疗过程中于(115±5)mm Hg之间波动，约15 min后恢复平衡。    2.3  治疗动物的检测结果比较    2.3.1  血氨浓度变化    两组犬治疗前高达150 mmol/L左右，经CBCBALSS治疗2、4和6 h，治疗组血氨下降均显著低于对照组(图2)。    2.3.2  ALT浓度变化    两组犬治疗前高达400 U/L左右，经CBCBALSS治疗后，ALT存在下降趋势，但仅在第6小时差异有统计学意义(图3)。    2.3.3  TBil/DBil浓度变化    两组犬治疗前高达80/55 mmol/L左右，经CBCBALSS治疗4、6 h后，治疗组TBil/DBil下降显著低于对照组(图4、5)。    2.3.4  白蛋白(ALB)浓度变化    两组犬治疗前达35 g/L左右，经CBCBALSS治疗后，所有时段检测浓度差异均无统计学意义(图6)。    2.3.5  Factor Ⅶ    两组犬治疗前达35%、20%左右，经CBCBALSS治疗后，Factor Ⅶ均没有显著差异(图7)。    2.3.6    BCAA/AAA    两组犬治疗前达1.6左右，经CBCBALSS治疗后，BCAA/AAA比差异无统计学意义(图8)。    2.3.7  MEGX    治疗1 h和2 h，两组间MEGX变化差异有统计学意义；治疗组MEGX比对照组提前2 h达到最高点(图9)。    2.4  肝细胞循环路的生化指标比较    2.4.1  ALT变化    在治疗过程中，细胞循环路ALT存在上升趋势，两组差异有统计学意义(图10)。因此，细胞循环路内存在损伤的肝细胞。    2.4.2  TBil/DBil变化    在治疗过程中，组间细胞循环路肝细胞的TBil/DBil变化差异无统计学意义，但两组在各时间点均非常显著性升高(图11、12)。    2.4.3  ALB变化    在治疗过程中，细胞循环路肝细胞的ALB变化差异无统计学意义(图13)。3  讨论    BALSS是近年来肝脏疾病研究领域的前沿课题，是治疗急、慢性肝功能衰竭的有效手段［4］。本研究采用CBCBALSS治疗20只AFH犬，治疗成功率高达80%，治疗中生命体征平稳，CBCBALSS的代谢支持作用明显。    3.1  CBCBALSS治疗过程中实验动物的表现    本组实验治疗20只AFH犬，转流中生命体征平稳16只，占80%。治疗开始到30 min左右，均出现一过性低血压，但是随后双循环路压力慢慢恢复至平衡约为115 mm Hg，时有波动，一般在15 min后趋于平衡。一过性低血压可能与体外循环引出了大量的血液(250 ml，约为血容量的25%)有关，故在治疗开始就快速补液至转流后30 min，总补液量在250 ml左右，基本可以维持生命体征平稳；在治疗时，双循环压力与循环路流速密切相关，循环路血液流速应尽量控制在30～50 ml/h，细胞循环路流速50～100 ml/h， 并且转流中维持补液量150 ml/h， 保证血容量， 维持生命体征平稳。    治疗时实验组2只出现生物膜性过敏反应。过敏反应一般出现在转流开始的30 min。经过总结，我们在转流前常规静脉推注地塞米松10 mg，以后的10只治疗犬均没有出现过敏反应，故转流前地塞米松静脉推注，可能会有效的预防过敏反应的发生。我们认为，治疗过程中的过敏反应与生物膜相关性大，其原因有待进一步探讨。    2只犬在转流中出现上消化道出血和穿刺部位(腹股沟部)大面积血肿、渗血至腹膜后间隙,可能系循环血路抗凝导致患犬的凝血功能受损。体外循环需用抗凝剂，而肝衰犬肝脏合成功能下降导致凝血机制障碍又限制了抗凝剂的应用，因而肝素的应用剂量及方法十分重要。目前国外应用较多的是低分子肝素，虽比较安全，但价格昂贵，国内仍以普通肝素钠为主。我们的经验是：治疗时每小时测定凝血时间，据此及时调整首剂肝素用量、维持量和鱼精蛋白量。治疗结束时若凝血时间超过正常50%(18～20 s)，适当应用鱼精蛋白中和体内过量肝素。我们采用双腔穿刺管减少了穿刺的次数，实践中不断提高一次性穿刺成功率，治疗结束后延长局部压迫时间，术中及时补充血容量，并加强凝血功能的监测，有效的控制并发症的发生，保证了实验的顺利完成。    3.2  CBCBALSS的代谢支持作用    本模型系门腔分流、胆总管离断致缺血+淤胆的AHF，其治疗前血氨、ALT、TBil/DBil浓度、ALB、Factor Ⅶ和BCAA/AAA分别达150 mmol/L、400 U/L、 80/55 mmol/L、 35 g/L、 20%和1.6； 经CBCBALSS治疗6 h后，血氨和TBil/DBil下降均显著低于对照组；ALT存在下降趋势，仅在第6小时差异有统计学意义；ALB、Factor Ⅶ和BCAA/AAA在所有时段和组间差异无统计学意义。这些结果表明：对AHF治疗，CBCBALSS具有十分有效的代谢支持作用。本研究的结果为急慢性肝功能衰竭的治疗提供了可靠的理论依据。    利多卡因主要在肝脏内迅速代谢，约90%经肝细胞色素P450系统去烷基化作用后产生MEGX和甘氨酸二甲苯胺(glycinexylidid,GX)。文献报道［5］健康人血浓度在静注利多卡因后0～15 min内快速上升，15 min达高峰，15～60 min内浓度维持不变。而肝病患者MEGX浓度增加较慢，大约在注射后4 h达高峰 ［6］。对比本实验MEGX结果，治疗1 h和2 h，两组MEGX变化差异有统计学意义；治疗组MEGX最高点比对照组提前2 h，此结果高度支持CBCBALSS肝细胞在治疗中发挥的代谢支持作用。这与AFH犬代谢密切相关，与文献报道相同，也与本课题肝细胞细胞闭合循环离体实验结果基本一致［1］。    3.3  CBCBALSS的膜透析作用    Bioliv生物反应器的聚砜膜孔径为0.2 μm，能通透分子量10×104以下的分子，特别是胆红素等低分子毒性物质［7］。但是在治疗过程中，该系统细胞循环路胆红素水平未达到模型犬的胆红素水平。因此，该系统具有明显的肝脏代谢支持作用。由于循环体积小，透析作用不显著。如果利用该系统，采用肝细胞静止培养和持续置换原理，有可能排出体内大部分低分子毒性物质，其功能相当于非生物人工肝的持续超滤。    3.4  模型犬对CBCBALSS内肝细胞的毒性作用    在治疗过程中，细胞循环路肝细胞的ALT显著性升高，同时与静止培养的肝细胞ALT相比，差异有统计学意义，故高度提示在治疗过程中肝细胞受到了一定损害。CBCBALSS系闭合式系统，体内低分子毒物可在细胞循环路聚集，破坏细胞生存的微环境，影响肝细胞功能，乃至损伤肝细胞。故在治疗过程中，定时更换细胞培养液，在一定程度上可以减轻毒性物质的聚集。    为了及时的清除体内蓄积大量毒性物质，短时间(6 h)内仅仅依靠CBCBALSS治疗，是远远不够的。为了达到更好的治疗效果，肝细胞发挥最佳功能，则可将血液或血浆先经非生物部分解毒，再通过生物反应器进一步清除余下毒性分子，并分泌一些肝细胞再生因子入血，此即组合型生物人工肝支持系统(Hybrid bioartificial liver support system，HBALSS)的基本理念［8］。【参考文献】［1］ 余德才，徐庆祥，陈钟，等.闭合型双循环生物人工肝支持系统的构建［J］.消化外科，2003，2(3)：163-167.［2］ Seglen P O. 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