幽门螺杆菌尿素通道蛋白基因UreI载体的构建、融合表达及纯化

作者：杨丽娟，姜政，向廷秀，陶小红，王丕龙    作者单位：重庆医科大学附属第一医院消化内科，重庆 400016

【摘要】  　　目的 构建幽门螺杆菌(H.pylori, Hp)尿素通道蛋白基因UreI的融合表达载体，并在E.coli BL21中表达，为进一步研究UreI的功能奠定基础。方法 利用分子克隆技术以Hp DNA染色体为模板，扩增Hp UreI基因片段，将目的基因UreI与载体pET32a(+)分别经kpnⅠ和HindⅢ双酶切，纯化，连接。筛选阳性重组载体，转化大肠杆菌BL21，以IPTG诱导表达pET32a(+)/UreI融合蛋白。表达产物经Ni-NTA琼脂糖树脂纯化后，用SDS-PAGE及Western blot分析。结果 经酶切、测序分析表明，插入的基因片段为Hp UreI编码基因，由585 bp组成，与GenBank相应菌株HP AM417 609序列完全一致，无碱基突变。经SDS-PAGE分析显示重组质粒pET32a(+)/UreI在原核细胞中得到了高效融合表达，其重组融合蛋白分子量为130 ku，经Ni-NTA琼脂糖树脂纯化后，其纯度达95%以上，Western blot分析显示，该重组融合蛋白可被6-His鼠抗单克隆抗体所识别，具有良好的反应原性。结论 成功地克隆和构建了原核表达载体pET32a(+)/UreI，并在原核细胞中得到了高效融合表达。

【关键词】  幽门螺杆菌 尿素通道蛋白(UreI) 原核表达

　　Construction urea channel protein (UreI) of humanHelicobacter pylori and expression in E.coli

　　Yang Lijuan, Jiang Zheng, Xiang Tingxiu, Tao Xiaohong, Wang Pilong

　　(Department of Gastroenterology, the First Affiliated Hospital,Chongqing University of Medical Sciences, Chongqing 400016, China)

　　ABSTRACT: Objective  To construct the prokaryotic expression vector of the urea channel protein gene (UreI) of Helicobacter pylori and make it expressed in E.coli BL21. Methods  The target gene encoding UreI was amplified from Hp DNA by PCR, digested by restricted endonuclease enzyme of HindⅢ, KpnⅠ simultaneously, and inserted into prokaryotic expression vector pET32a(+) digested by corresponding restricted endonuclease enzyme. The recombinant plasmid was used to select and identify by restricted endonuclease enzyme digestion and sequence analysis and transform, meanwhile induce it to be expressed in E.coli BL21 by IPTG. The recombination fusion protein was purified by 6-His marked Ni-TEDTM kit and analysed by Western blot. Results  Restriction endonuclease analysis and sequencing showed that the target gene was found to be 585 base pairs and had been inserted into recombinant vector. As compared with gene HP AM417 609 reported by GenBank, cloned UreI gene sequence was completely matched and composed of 585 bp. SDS-PAGE analysis showed that the recombinant plasmid pET32a(+)/UreI could be expressed in E.coli BL21, its relative molecule mass of expressed product was 130 ku. After purified with Ni-NTA agarose resin, the purity of recombinant fusion protein was about 95%. Western blot results showed that the recombinant fusion protein could be identified by anti-6-His monocloned antibody, suggesting that this fusion protein has good reactionogenicity. Conclusion  The gene coding for UreI is cloned and expressed successfully.

　　KEY WORDS: Helicobacter pylori; urea channel protein gene (UreI); prokaryotic expression

　幽门螺杆菌(Helicobacter pylori, Hp)是上消化道疾病的主要致病菌，它的感染不但与B型胃炎和消化性溃疡的发生有密切关系，而且与非溃疡性消化不良、MALT淋巴瘤和胃癌的发生也有重要关系，并已被世界卫生组织列为胃癌等肿瘤发生的相关因素［1］。Hp在我国普通人群的感染率较高(50%-80%)，并仍以每年1%-2%速度增加［2］。目前认为Hp的免疫防治将是减少胃癌以及消化性溃疡的最有效和最经济的办法。

　　幽门螺杆菌尿素通道蛋白(UreI)在Hp致病中起到了最为关键的作用。在酸性环境下，UreI激活尿素酶分解尿素产生氨，而氨的生成是Hp对抗胃酸、耐受胃酸以及在胃内定植的基础，因此UreI是Hp在胃内定植最关键的一个环节［3］。Hp的持续感染与UreI有重要的关系，抑制UreI的表达，从而抑制尿素跨膜转运，使Hp对酸不耐受，进而不能在胃内强酸环境中定居，达到根除Hp及其相关疾病的目的，因此以UreI为抗原的Hp疫苗将具有广阔的应用前景。本文对Hp尿素通道蛋白UreI基因进行克隆，构建重组质粒pET32a(+)/UreI,并在E.coli中进行表达，为进一步研究UreI的功能奠定基础。

　　1  材料与方法

　　1.1  菌株和质粒

　　Hp由本校微生物学教研室提供，DH5α菌株，BL21(DE3)表达菌和pET32a(+)载体为本校病毒性肝炎所保存。限制性内切酶HindⅢ、KpnⅠ及Tag DNA聚合酶购自TaKaRa大连公司，T4DNA连接酶购自Promega公司。柱离心式胶回收试剂盒、质粒抽提试剂盒购自Omega公司。鼠抗6-His单抗、羊抗鼠IgG-HRP购自北京中山公司。

　　1.2  基因组DNA的提取

　　参考文献报道［4］，取1.5 mL Hp培养物，12 000 r/min，离心2 min。取沉淀，加入567 μL的TE缓冲液，混悬。再加入100 g/L SDS 30 μL和20 g/L蛋白酶K 3 μL，于37 ℃温育1 h。依次加入5 mol/L NaCl 100 μL和100 g/L SDS 80 μL，于65 ℃温育10 min。用酚及酚/氯仿各抽提3次，收集上清液转入EP管中，加入0.6倍于上清液的异丙醇，12 000 r/min，离心15 s。取沉淀，加入700 mL/L乙醇1 mL洗涤，再以12 000 r/min离心5 min。弃上清液，将沉淀溶于100 μL TE中，于-20 ℃保存备用。

　　1.3  UreI编码基因扩增

　　参照GenBank中Hp AM417 609序列，结合所用载体pET32a(+)序列，以Hp基因组DNA为模板扩增出大小为585 bp UreⅠ基因片段，设计UreⅠ编码基因的引物P1和P2。P1的序列为5′CGGGGTACC-ATGCTAGGACTTGTATTGT3′；P2的序列为5′CCCAAGCTT-CACCCAGTGTTGGATAA3′。P1引物中引入KpnⅠ酶切位点，P2引物中引入HindⅢ酶切位点。PCR扩增条件：94 ℃预变性5 min，95 ℃变性50 s，56 ℃退火50 s，72 ℃延伸1 min，最后1个循环结束后再72 ℃延伸5 min，共35个循环。所得PCR产物进行10 g/L琼脂糖凝胶电泳及胶回收。

　　1.4  重组载体的构建

　　①目的基因与载体的连接：将纯化的PCR产物和pET32a(+)，分别以KpnⅠ和HindⅢ双酶切，并进行胶回收。将酶切胶回收的目的基因与pET32a(+)按5∶3(分子数比)在16 ℃ T4DNA连接酶作用下连接过夜。②转化感受态菌DH5α：取150 μL DH5α菌的过夜培养物，加于3 mL的LB培养液中，以300 r/min震荡培养4 h，然后在室温下以12 000 r/min离心2 min。弃上清液，加入150 μL预冷的100 mmol/L CaCl2混悬，而后加入连接产物10 μL，混悬。依次进行0 ℃冰水浴中30 min、42 ℃水浴中2 min，0 ℃冰水浴中2 min。加入1 mL LB培养液，于37 ℃，200 r/min震荡培养50 min；取500 μL培养物，涂于LB+氨苄青霉素100 mg/mL的平皿上，于37 ℃过夜。③重组载体的提取：挑选单个菌落，接种于3 mL LB+氨苄青霉素100 mg/mL的培养液中，于37 ℃，300 r/min培养12 h。提取质粒，同时进行酶切鉴定和基因测序分析。

　　1.5  重组载体在E.coli中的表达

　　以酶切鉴定正确的重组载体pET32a(+)/UreI转化E.coli BL21(DE3)，随后挑选含重组载体的单个菌落接种于盛有LB培养基的试管(含氨苄青霉素100 mg/mL)中。与BL21(DE3)和pET32a(+)/BL21菌一起，于37 ℃培养至对数生长期A600=0.4-0.6时，加入终浓度为1.0 mmol/L的IPTG，37 ℃分别诱导表达4、6、18 h，以12 000 r/min离心2 min。收集菌体，加入蛋白上样缓冲液煮沸5 min，进行120 g/L SDS-PAGE，筛选高表达的含重组质粒的单个菌落，以获得大量的重组蛋白。

　　1.6  表达产物的纯化

　　由于融合表达蛋白的C端融合了6个组氨酸，故表达产物采用Ni-NTA琼脂糖树脂进行纯化。将100 mL LB培养基制备的细菌，混悬于10 mL超声破碎液(50 mmol/L NaH2PO4和300 mmol/L NaCl，pH7.0)中，在2 000 J，4 ℃的低温条件下，超声破碎20 min，以4 ℃，2 000 r/min，离心20 min，加包涵体溶解液(100 mmol/L NaH2PO4、10 mmol/L Tris及8 mol/L尿素)充分混匀，室温溶解2 h。4 ℃，2 000 r/min，离心20 min。取上清液过Ni-NTA琼脂糖树脂柱，加纯化蛋白洗涤液(50 mmol/L NaH2PO4、300 mmol/L NaCl及20 mmol/L咪唑，pH 7.8)10 mL洗涤2次，然后用洗脱液(50 mmol/L NaH2PO4、300 mmol/L NaCl，250 mmol/L咪唑，pH7.8)10 mL洗脱，并分3段收集。分别取3段收集液各100 μL，以等量2×蛋白上样缓冲液混匀后，煮沸5 min，进行120 g/L SDS-PAGE鉴定蛋白表达量。

　　1.7  重组融合蛋白反应原性检测

　　将诱导培养的BL21/pET32a(+)/UreI细菌2管各1.5 mL，阴性对照BL21表达菌，离心，在沉淀中加入蛋白上样缓冲液，煮沸5 min进行120 g/L SDS-PAGE电泳，标明1、2泳道，剪下分子质量在130 ku处的胶，120 g/L SDS-PAGE电泳，半干法转印蛋白质到NC膜上，放入TBST脱脂奶粉封闭液中(电压23 V，45 min)，37 ℃孵育2 h，PBS室温振摇洗膜3次，每次5 min。加入一抗6-His单抗(1∶2 000)，37 ℃孵育2 h，PBS洗膜3次，每次5 min。加入二抗含辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG(1∶5 000)的TBST脱脂奶粉液中，37 ℃孵育1 h，PBS洗膜3次，每次5 min，ECL化学发光，观察结果。

　　2  结果

　　2.1  目的基因ureI的扩增

　　以Hp基因组DNA为模板进行PCR扩增。所获PCR产物进行10 g/L琼脂糖凝胶电泳分析(图1)。结果表明，PCR扩增产物位于500-750 bp之间，大小约为585 bp，与设计相符。

　　2.2  重组载体的酶切鉴定

　　重组载体pET32a(+)/UreI经KpnⅠ 、HindⅢ双酶切后得到1条约为585 bp的带，为目的基因片段，与实验设计相一致，证明重组载体构建成功(图2)。

　　2.3  重组质粒基因序列分析

　　重组载体的测序结果表明插入的基因片段为585 bp，与设计一致。与GenBank中的登记号HP AM417 609序列完全一致，无碱基突变。

　　2.4  重组载体pET32a(+)/UreI在E.coli中的表达

　　重组载体pET32a(+)/UreI转化E.coli BL21，经IPTG诱导4 h和6 h，未表达目的蛋白，诱导18 h后，表达目的蛋白，其分子质量大小为130 ku左右，为四聚体，以包涵体形式表达。通过Quantity-one软件分析，融合蛋白的表达量约占菌体总蛋白的20%。诱导培养的细菌经超声破碎、Ni-NTA琼脂糖树脂柱纯化后，通过SDS-PAGE以及Quantity-one软件分析，获得纯度达90%以上的终产物(图3)。

　　2.5  Western blot检测重组融合蛋白反应原性

　　以纯化的融合蛋白为抗原，一抗为鼠抗6-His单抗，二抗为HRP标记的羊抗鼠IgG。Western blot结果显示，在BL21(DE3)/pET32a(+)/UreI(1)泳道上相应于其表达产物相对分子量的地方出现了目的条带，而BL21菌(2)的泳道上未出现任何条带(图4，ECL化学发光)。

　　3  讨论

　　幽门螺杆菌是人类最常见的致病菌，Hp感染与多种疾病有关。如何预防和根除Hp感染是目前临床治疗的重点，而免疫疗法有望成为治疗该类感染性疾病的最有效、最有前景的方法之一。由于Hp属微需氧菌，培养条件高，难以获得大量天然的菌体蛋白，同时口服对攻击感染的保护力较低，而且全菌体蛋白的抗原成分复杂，存在由交叉反应引起一系列不良反应的可能性。因此，研究Hp亚单位疫苗已成为了必然。到目前为止，已分离得到且有肯定免疫效果的抗原基因有尿素酶B、18 ku、26 ku外膜蛋白(OMP)、细胞毒相关蛋白(CagA)、细胞空泡毒素(VacA)以及热休克蛋白基因等。但采用上述抗原制作疫苗均受到了不同程度的限制，因此我们选择尿素通道蛋白(UreI)进行研究，目前关于此类报道甚少。UreI即Hp尿素通道蛋白，是Hp在胃内酸性环境下存活的最关键的因素。Weeks等研究发现UreI增加尿素通透性，是Hp通过胃液所必要的，对在胃上皮表面生长繁殖是必不可少的［5-6］。Mollenhauer等用野生型Hp感染蒙古沙鼠，UreI基因缺失的Hp突变体不能在胃内定植［7］；Bury则进一步指出UreI是Hp在胃内定植最关键的一个环节［8］。在酸性pH中，只要尿素浓度在1 mmol/L的情况下，UreI就能够迅速转运尿素，而尿素在尿素酶的作用下产生氨，使pH达到6.0以上，这就是Hp能够在pH<4.0条件下存活的重要原因［9-10］。体外实验缺失UreI基因则阻止尿素酶的激活，从而使Hp失去了对抗胃酸、耐受胃酸的特性，也就失去了在胃内定殖、生存的基础［11-12］。基于UreI在Hp致病过程中所起到的重要作用，以UreI为抗原的Hp疫苗将具有广阔的应用前景［13- 14］。

　　本次实验采用分子克隆技术，将目的片段UreI克隆到表达载体从而获得重组蛋白。因原核表达相对简单，具有产量高、易操作、稳定性好等优点，故采用原核表达载体pET32a(+)，其含有T7启动子和转录终止信号，能够编码6个组氨酸残基，还带有大肠杆菌的TrxA基因。TrxA基因可编码109个氨基酸的硫氧还蛋白，外源基因经多克隆位点插入后，可与TrxA一起融合表达。其与外源蛋白的融合表达可增加表达产物的可溶性,还可保护外源蛋白不易被降解。而且由于分子质量增大，用SDS-PAGE更容易分析鉴定。宿主菌选择了具有较低蛋白酶活性的E.coli BL21(DE3)。重组蛋白经1.0 mmol/L IPTG诱导18 h后，在相对分子质量为130 ku左右处有一明显表达的条带，表达量占全菌蛋白的20%以上，但分子大小与预期不同，推测为四聚体形式表达，即4条肽链连接形成四聚体(单体肽链相对分子质量为38 ku)。重组蛋白以包涵体的形式存在，因其具有不溶性和致密性的特点，而利于分离和纯化。由于载体pET32a(+)表达的6个组氨酸可与Ni-NTA琼脂糖树脂中的Ni2+结合，从而可对表达产物进行纯化，纯化后的重组蛋白通过Western blot检测表明工程菌表达的重组融合蛋白(rUreI/His)能与His-tag mAb反应,有良好的反应原性。本实验成功构建了重组原核表达载体pET32a(+)/UreI，并在E.coli BL21(DE3)中成功表达了重组融合蛋白。这些研究对进一步研究Hp UreI的蛋白质疫苗奠定了基础。

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