Caspase9和Bax在胃癌中的表达以及与凋亡的关系

　　作者：潘科, 刘丽娜, 卢书明 于劲达 作者单位：(1.黔南州人民医院 消化内科， 贵州 都匀 558000; 2.大连医科大学 消化内科， 辽宁 大连 116021; 3.包头医学院， 内蒙古 包头 014100)

　　【摘要】 目的： 探讨Caspase9和Bax在胃癌发展中的作用以及二者的表达与细胞凋亡的关系。方法: 应用免疫组织化学SP法检测 Caspase9和Bax在57例胃癌及48例非癌胃黏膜组织的表达，用原位末端标记法(TUNEL法)检测相应胃组织细胞凋亡。结果： Caspase9蛋白在胃癌组织中阳性表达率为40.35%，较非癌胃黏膜组织的阳性表达率70.83%明显降低(P<0.05);Bax蛋白在胃癌组织中阳性表达率为35.09%，明显低于非癌胃黏膜组织的72.92%(P<0.05)。Caspase9蛋白阳性表达者细胞凋亡指数(AI)值(11.20±3.39)%与其阴性者AI值(6.22±2.45)%比较差异有显著性(P<0.05);Bax蛋白阳性表达者AI值(12.54±3.60)%，与其阴性者AI值(7.18±1.25)%比较差异有显著性(P<0.05)。在不同类型胃癌组织中，高中分化腺癌、低分化腺癌、黏液癌的AI值分别为(5.72±1.25)%、(2.54±0.98)%、(3.28±1.42)%，其中高中分化腺癌和后二者之间有统计学差异(P<0.05)。结论： Caspase9和Bax可能与胃癌的发生或发展相关;推测Bax激活 Caspase9的线粒体通道受抑可能参与胃癌的发生。

　　【关键词】 胃肿瘤; 腺癌; 腺癌，粘液; 免疫组织化学

　　Expression of Caspase9 and Bax in Stomach

　　Cancer and Its Relation to Cell Apoptosis

　　PAN Ke1, LIU Lina2, LU Shuming2, YU Jinda3

　　(1.Department of Digestive Medicine, Qiannan District People's Hospital, Duyun 558000, Guizhou, China;

　　2.Department of Digestive Medicine, Dalian Medical University, Dalian 116021, Liaoning, China;

　　3.Baotou Medical College, Baotou 014100, Neimenggu, China)

　　[Abstract] Objective: To explore the effects of caspase9 and bax in the development of stomach cancer and the relation of their expression to cell apoptosis. Methods: Expression of caspase9 and bax in 57 specimens of stomach cancer and 48 specimens of noncancer stomach tissue was detected with immunohistochemistry SP method, and the cell apoptosis in stomach tissue detected with TUNEL method. Results: The positive expression rate of caspase9 in stomach canser tissue (40.35%) was significantly lower (P<0.05) than that in noncancer stomach tissue (70.83%). The positive expression rate of bas in stomach canser tissue (35.09%) was significantly lower (P<0.05) than that in noncancer stomach tissue (72.92%). The apoptosis index (AI) of caspase9 positive cases (11.20±3.39)% was different from that of caspase9 negative cases (6.22±2.45)%, and the difference was significant (P<0.05). The AI of bax positive cases (12.54±3.60)% was different from that of bax negative cases (7.18±1.25)%, and the difference was significant (P<0.05). AI values in welldifferentiated adenocarcinoma (WDA), poorly differentiated adenocarcinoma (PDA), and colloid carcinoma (CC) were(5.72±1.25)%,(2.54±0.98)%, and(3.28±1.42)% respectively. There were significant differences between WDA AI and PDA AI, and between WDA AI and CC AI (P<0.05). Conclusions: Caspase9 and bax might be related to the occurrence and development of stomach cancer. The inhibition of mitochondrial channel for caspase9 stimuted by bax might participate the initiation of stomach cancer.

　　[Key words] stomach neoplasms; adenocarcinoma; adenocarcinoma,mucinous; immunohistochemistry

　　随着胃癌发病机理研究的深入，已发现胃癌的发生发展与胃癌细胞凋亡密切相关。目前关于胃癌细胞凋亡及其调节机制的研究已成为人们关注的热点之一。Caspase是一个半胱氨酸蛋白酶家族，其家族成员在细胞凋亡过程中起着重要的作用。细胞凋亡的线粒体途径中，Caspase9位于级联反应上游，是最重要的起始因子之一，在其他蛋白参与下发生自我激化并激活下游的Caspase因子，然后引起级联放大效应，从而导致细胞的凋亡。Bax又称Bcl2同源拮抗蛋白-致死蛋白，是Bcl2家族的一个成员，Bax既可形成同聚体促进凋亡，又可以与Bcl2形成杂二聚体抑制后者的抗凋亡效应，Bax促进细胞凋亡的主要机制是诱导细胞色素C从线粒体释放至细胞浆，与凋亡蛋白酶活化因子(Apaf1)结合，然后激活 Caspase9启动凋亡级联反应，导致细胞凋亡。2007年应用免疫组织化学SP法检测 Caspase9和Bax在不同胃黏膜组织的表达，用原位末端标记法(TUNEL法)检测相应胃黏膜组织细胞凋亡，初步探讨Caspase9和Bax在胃癌的发生发展中的作用以及二者的表达与细胞凋亡的关系。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　收集大连医科大学附属第一医院2005年10月～2006年8月因上消化道症状行胃镜检查的胃癌及非癌胃黏膜标本105例，其中胃癌组57例，非癌胃黏膜组48例，均经病理组织学证实。胃癌组男42例，女15例，年龄37～85岁，平均年龄64.07岁。其中高中分化腺癌14例，低分化腺癌34例，粘液癌9例。所有对象受检前均未经放疗、化疗等治疗。非癌胃黏膜组男34例，女14例，年龄41～85岁，平均年龄64.10岁。活检标本经10%中性福尔马林溶液中固定，48 h后常规石蜡包埋，连续切片(切片先用多聚赖氨酸处理)，切片厚4 μm。胃癌病理诊断采用WHO推荐的组织学分型[1]。

　　1.2 免疫组织化学检测

　　1.2.1 免疫组织化学试剂 Caspase9兔抗人多克隆抗体(即用型)，Bax鼠抗人单克隆抗体(即用型)，SP试剂盒均购自福州迈新生物技术公司。

　　1.2.2 检测方法 染色步骤按说明书进行。阳性对照为已知表达阳性的组织切片，以PBS代替一抗作为阴性对照。Caspase9蛋白以细胞核或胞浆出现棕黄色颗粒为阳性细胞，Bax蛋白以细胞浆出现棕黄色颗粒为阳性细胞。以每张切片在400倍镜下观察整体染色情况，选择有代表性的区域，随机读取 100个细胞。阳性细胞率=阳性细胞数/总细胞数×100%。切片中阳性细胞率≥5%为阳性病例，<5%为阴性病例。

　　1.3 用TUNEL法检测胃癌和非癌胃黏膜组织的细胞凋亡率

　　1.3.1 试剂 细胞凋亡原位检测试剂盒由美国Roche公司提供。

　　1.3.2 检测方法 染色步骤按说明书进行。每种抗体均设阳性和阴性对照，阳性对照为已知表达阳性的组织切片，阴性对照以PBS代替Tunel反应液。凋亡细胞核呈紫玫瑰红色，以此为阳性细胞。每例切片在高倍镜下随机读取100个细胞(不含坏死组织的视野)，凋亡指数(apoptosis index,AI)=阳性细胞数/总细胞数×100%。

　　1.4 统计学方法

　　检验方法用χ2检验，确切概率法统计分析数据，P<0.05(双侧)为差异有显著性。计量资料用x±s表示，组间比较用t检验，全部统计处理均在SPSS10.0软件中进行。

　　2 结果

　　2.1 Caspase9和Bax在胃癌和非癌胃黏膜组织中的表达

　　Caspase9蛋白在57例胃癌组织中有23例阳性表达，阳性表达率为40.35%，48例非癌胃黏膜组织中有34例阳性表达，阳性表达率为70.83%，两者相比差异有显著性(χ2=9.76，P>0.05)。Bax蛋白在57例胃癌组织中有20例阳性表达，阳性表达率为35.09%，48例非癌胃黏膜组织中有35例阳性表达，阳性表达率72.92%，两者差异有显著性(χ2=14.95，P>0.05)。见表1。表1 Caspase9和Bax在胃癌和非癌胃黏膜组织中的表达

　　2.2 Caspase9、Bax表达与AI的关系

　　Caspase9蛋白阳性表达者凋亡指数(11.20%)与其阴性者(6.22%)比较差异有显著性(P<0.05);Bax蛋白阳性表达者凋亡指数(12.54%)与其阴性者(7.18%)比较差异有显著性(P<0.05)，提示Caspase9蛋白、Bax蛋白的表达和单位面积内细胞凋亡数呈正相关(见表2)。表2 Caspase9、Bax表达与细胞凋亡指数的关系

　　2.3 AI在不同胃癌组织中的情况

　　高中分化腺癌的平均细胞凋亡指数为5.72%，低分化腺癌和粘液癌的平均细胞凋亡指数分别为2.54%、3.28%，高中分化腺癌组的细胞凋亡指数与低分化腺癌、粘液癌组相比较，差异有显著性(P<0.05)。低分化腺癌组的细胞凋亡指数低于粘液癌组，无统计学差异(P>0.05)。见表3。表3 细胞凋亡指数在不同类型胃癌中的情况

　　2.4 胃癌组织中Caspase9和Bax的相关性

　　在胃癌组织Caspase9表达阳性的23例中有17例Bax表达阳性，在胃癌组织Bax表达阴性37例中Caspase9表达阴性31例，χ2值为5.52，两者有相关性(P<0.05)。

　　3 讨论

　　自从1972年Kerr等首先提出凋亡概念并对其特征加以描述后，细胞凋亡已成为生命科学领域关注热点之一。细胞凋亡(Apoptosis)，也称为程序性死亡，是一种为基因所调控的自主性的有序死亡过程[2]。目前人们已认识到肿瘤的发生不仅与细胞的异常增生、分化停滞有关，且与细胞凋亡失衡密切相关。

　　Caspase是一个半胱氨酸蛋白酶家族，该家族在氨基酸序列、结构及酶的特性上均相似，通常情况下以无活性的酶原形式存在于细胞中，酶原分子由3部分组成，一个N端前域及一大一小2个亚基，酶原分子激活后，大小亚基解离并重新组装为四聚体形式的活性酶，由于Caspase可自我活化并能相互激活，因此凋亡过程一旦触发，即呈级联放大效应。Caspase9位于级联反应上游，当凋亡起始信号作用于线粒体后，引起线粒体释放细胞色素C(cytc)，接着cytc与凋亡蛋白酶活化因子1(Apaf1)结合并使Apaf1改变构象形成八聚体，后者与Caspase9结合并诱导其发生自我催化，活化的Caspase9进一步激活下游的Caspase，使级联反应进一步放大[3]。因此，Caspase9是细胞线粒体依赖的凋亡途径中重要起始因子。

　　Bax是Bcl2基因家族中的一员，位于染色体19q13.3～19q13.4，含6个外显子，Bax既可形成同聚体促进凋亡，又可与Bcl2形成杂二聚体抑制后者的抗凋亡效应[4]。bax蛋白是1993年Oltvai等用单克隆抗体免疫沉淀等方法提取的一种蛋白质，bax蛋白与bcl2蛋白有21%的同源性，分子量为21 KD，由192个氨基酸组成。Bax促进细胞凋亡主要是通过加速线粒体中的cytc释放和增加Caspase的活性来实现的。

　　本研究结果显示，Caspase9在胃癌组织中的阳性表达率为40.35%，明显低于在非癌胃黏膜组织中的阳性表达率70.83%(P<0.05)，与文亚渊[5]等采用RTPCR方法测定正常胃组织及胃癌组织中Caspase9的mRNA的表达情况一致。本试验还观察到Caspase9蛋白的表达与AI相关，Caspase9蛋白的表达愈低，细胞凋亡指数愈小，提示Caspase9参与细胞凋亡过程，其低表达时细胞凋亡受到抑制可能参与胃癌的形成。Park等[6]研究人胃癌细胞株的凋亡时发现，Caspase9在胃癌细胞的凋亡过程中发挥重要的作用。Caspase9蛋白低表达时细胞凋亡受到抑制的机制可能是Caspase9蛋白表达下降，其激活下游Caspase因子的能力降低，从而使细胞凋亡减少，细胞凋亡和增殖平衡打破，胃癌则可能发生。

　　本研究结果显示，Bax在胃癌组织中的阳性表达率为35.09%，明显低于在非癌胃黏膜组织中的阳性表达率72.92%(P<0.05)，此结果与文献报道一致[7，8]。提示在胃癌发生过程中可能有促凋亡基因Bax的参与，本研究还同时检测了非癌胃黏膜组织和胃癌组织的凋亡指数，发现前者显著高于后者(P<0.05)，表明Bax在非癌胃黏膜组织中发挥促进细胞凋亡作用，使之能保持一定的凋亡率，而在胃癌组织中Bax低表达时细胞凋亡可能减少，导致一些DNA受损的胃黏膜细胞逃避机体细胞正常凋亡机制而成为快速增殖的细胞，进而可能发展成胃癌细胞。

　　本实验显示Caspase9和Bax的阳性表达与凋亡指数密切相关，Caspase9和Bax阳性组的凋亡指数显著高于阴性组。本研究还发现二者在胃癌组织中表达有显著相关性，均呈现低表达。有研究发现在前列腺细胞癌的诱导凋亡基因治疗过程中，Bax基因主要通过线粒体途径激活Caspase，继而产生明显的细胞凋亡[9]。因此推测胃癌细胞中促凋亡基因Bax激活Caspase9的线粒体途径受到抑制，可能参与胃癌发生发展过程。

　　细胞凋亡不仅在肿瘤的发生发展过程中起重要的作用，而且与肿瘤治疗和药物敏感机制以及耐药性有关，目前已发现大多数抗癌药发挥其抗癌效应是通过诱导肿瘤细胞凋亡。有报道Bax高表达可增强化疗药丝裂霉素、阿霉素及顺铂的诱导凋亡作用，而Bax表达阴性已成为对化疗不敏感及生存期缩短的指标，因此可通过增加促凋亡基因的表达，为肿瘤治疗提供新靶点[10，11]。关于在胃黏膜组织中Bax基因对Caspase9激活的线粒体通道调控的机制有待进一步研究。

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　　[4]Kelekar A, Thompson CB. bcl2family proteins: the role of the BH3 domain in apoptosis[J].Trends Cell Biol,1998(8):324-325.

　　[5]文亚渊, 刘宝, 付涛. 胃癌组织中survivin,caspase3和caspase9基因表达的变化[J].第三军医大学学报,2005(21):2194-2195.

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