大鼠酒精性脂肪肝中Fbw7的表达

作者：商楠    作者单位：山东大学齐鲁医院消化内科， 济南 250012

【摘要】  目的 分析大鼠酒精性脂肪肝Fbw7 mRNA及蛋白的表达量，研究其在酒精性脂肪肝发病机制中的作用。方法 利用酒精灌胃的方法建立大鼠酒精性脂肪肝模型，于12周末处死大鼠。肝脏石蜡切片HE染色观察病理学改变，采用荧光定量PCR及Western blot方法测定大鼠肝组织Fbw7 mRNA含量及蛋白表达量。结果 光镜下，模型组肝脏出现明显脂肪病变，肝组织中甘油三酯含量明显高于正常对照组（P＜0.01），Fbw7 mRNA及蛋白水平亦降低（P＜0.01），并与甘油三酯含量呈负相关。结论 大鼠酒精性肝病时，Fbw7 mRNA及蛋白表达下降，可能在酒精性脂肪肝发病机制中发挥重要作用。

【关键词】  脂肪肝 酒精性 Fbox蛋白 固醇调节元件结合蛋白 泛素途径 大鼠 近交系

    SHANG Nan, YAN Ming, ZHANG Haitao, LIU Huimin

    (Department of Gastroenterology, Qilu Hospital of Shandong University, Jinan 250012, China)

    To evaluate the expressions of Fbw7 mRNA and protein in rat models of alcoholic fatty liver disease and to investigate the effect of Fbw7 in the pathogenesis of alcoholic fatty liver disease. Methods  Rat models of alcoholic fatty liver disease were establish by saline i.g. and sacrificed at 12 weeks. Liver histology was determined by HE staining. Expressions of Fbw7 mRNA and protein were determined by QPCR and Western blot. Results  Liver steatosis was found by light microscopy in the model group. Compared with the control group, contents of TG were increased in the model group (P＜0.01) and expressions of mRNA and protein were decreased in the model group (P＜0.01) which negatively correlated with TG content. Conclusion  Alcohol administration results in a decrease of Fbw7 expression, which may play a vital role in the pathogenesis of alcoholic liver disease.

    Key words：  Alcoholic fatty liver; Fbox protein;  Sterol regulatory elementbinding proteins; Ubiquitin, way; Rats, inbred strains     酒精性脂肪肝的分子机制中，固醇调节元件结合蛋白（sterol regulatory elementbinding proteins, SREBPs）是近年来研究中的一个关键因子［1］,经泛素-蛋白酶体系统（ubiquitinproteasome system，UPS）降解，并依赖于特定的因子Fbw7［23］。Fbw7是一种Fbox蛋白，具有特异性底物识别能力［4］。在酒精性肝病研究中， Fbw7的表达国内外尚无报道。故本实验旨在测定酒精性大鼠肝病模型中Fbw7的mRNA含量及蛋白表达量变化，并对肝脂肪化的血清学指标进行相关分析，探讨Fbw7在酒精性脂肪肝发病机制中的作用。

    1  材料与方法

    1.1  材料  成年健康雄性Wistar大鼠30只（4周龄），体质量（180±10）ｇ，购自山东大学实验动物中心；北京红星牌二锅头酒（60度）；橄榄油（不饱和脂肪酸含量大于90%，产自西班牙Algemesi公司；Trizol试剂盒购自Invitrogen公司；MMLV逆转录酶购自美国Promega公司；SYBR Premix EX TaqTM酶购自大连宝生物工程有限公司；蛋白酶抑制剂购自Roche公司；兔抗大鼠Fbw7多克隆抗体购自SANTA CRUZ公司；辣根酶标记山羊抗兔IgG 购自SANTA CRUZ公司；蛋白质分子量标准参考物购自New England Biolabs公司；硝化纤维素膜（0.2?μm）购自Amersham Phamacia Biotech公司；内参兔抗鼠Actin抗体购自SANTA CRUZ公司；ECL化学发光液购自Amersham Biosciences公司。

  1.2  动物模型的建立  将大鼠30只分笼喂养，每笼5只，室温控制在(22～26)℃，湿度控制在40%～70%，采用12?h的人工日夜循环照明（照明时间从6:00?am～6:00?pm）。正常喂养１周后，随机分为2组，即酒精性肝病模型组和橄榄油饮食对照组，对照组及模型组各15只。酒精性肝病模型组采用橄榄油饮食加酒精灌胃的方法建立动物模型，其食物构成为：酒精提供总热卡的56%（每日分2次灌胃，时间间隔8?h），蛋白质提供18%，脂肪提供14%（其中9%为不饱和脂肪酸），碳水化合物提供12%，同时给予维生素复合物和必需矿物质。1～4周给予40%酒精5?g/kg·d，5～8周给予50%酒精7?g/kg·d，9～12周给予60%酒精10?g/kg·d，诱导大鼠酒精性脂肪性肝病模型。橄榄油饮食对照组按照酒精性肝病模型组橄榄油比例给予，同时给予相同体积的无菌生理盐水灌胃至12周末。

    1.3  标本制备及肝组织病理检测  10%水和氯醛按0.3?mＬ(100?g/kg)腹腔注射麻醉后，心脏穿刺取血，3?500?r/min离心10?min，取上清，-80?℃冰箱保存或直接用HITACHI7170A全自动生物化学分析仪检测TG。收集肝组织，部分于4%中性甲醛溶液固定24?h后转移到0.1?mmoL/L PBS溶液中保存，部分迅速转移到-80?℃冰箱保存。肝组织石蜡包埋，切片、HE染色。

    1.4  Fbw7亚基mRNA含量的测定

    1.4.1  肝组织RNA提取  按Trial试剂盒（Invitrogen 公司）说明书提取肝组织总RNA，紫外分光光度计测定RNA含量及纯度，并证实其A260/A280比值为1.8～2.0。

    1.4.2  逆转录（RT）反应  配制20?μL反应体系（RNA 1?μL；MMLV 1?μL；逆转录反应体系7?μL；随机引物2?μL；去RNase水补至20?μL），扩增参数为：37?℃ 1?ｈ，95?℃ 5?min。

    1.4.3  RTPCR扩增  Fbw7引物序列为：上游引物5′GTCCCAGCAAGCATCAGAGC３′，下游引物5′CGGA

    TAAATTCACCCGTTTT 3′，扩增产物长度为117?bp；以βactin为内参照，其上游引物序列为5′CGTTGACATCCGTAAAGACC 3′，下游引物序列为5′TAGAGCCACCAATCCACA 3′，扩增产物长度为176?bp。引物由上海英骏生物技术有限公司合成。PCR反应体系为20?μL，含SYBR荧光染料10?μL，上游引物1.0?μL，下游引物1.0?μL，cDNA 1?μL，双蒸水7.0?μL。反应条件为：95?℃ 10?s；95?℃ 0?s，57?℃ 10?s，72?℃ 15?s，40个循环。每个循环结束时系统检验相应荧光信号。内参βactin反应条件：95?℃ 10?s；95?℃ 0?s，60?℃ 10?s，72?℃ 15?s，40个循环。反应完成后分析熔解曲线。

    1.5  Western blot方法检测Fbw7蛋白表达  用组织裂解液,将冻存肝脏裂解、匀浆，提取蛋白。考马斯亮蓝检测各标本蛋白浓度，每个标本取20?μg总蛋白分别加样，电泳120?V 90?min,转膜200?mA  4?℃ 1?h，考马斯亮蓝染色评价转膜效率，5%的脱脂奶粉封闭过夜。1∶500稀释的抗Fbw7 兔抗大鼠多克隆一抗, 4?℃杂交过夜,1∶1?000稀释的辣根过氧化酶标记的羊抗兔二抗,室温反应2?h,ECL法显影，凝胶影像分析仪测定蛋白灰度。

    1.6  统计学处理  使用 SPSS 11.5统计软件对结果进行分析。结果用±s表示，各组样本均数的比较采用两样本t检验法，荧光定量PCR Fbw7含量采用２-△△CT法分析，Fbw7 mRNA含量及蛋白表达量与甘油三酯含量之间的关系采用相关分析。

    2  结  果

    2.1  肝组织病理学表现  见图１。图1A为正常对照组表现，图1B为病变模型组的表现，模型组细胞内出现较多脂滴，肝细胞细胞核被推挤至细胞一侧，甚至细胞内含有大量脂滴，肝细胞肿大变圆，酒精性脂肪肝建模成功。

  2.2  肝组织TG检测  TG含量在模型组［（2.327±0.080）mmoL/L］明显高于对照组［（1.292±0.116）mmoL/L］（P＜0.01）。

    2.3  肝组织Fbw7基因表达  荧光定量PCR熔解曲线分析,应用２-△△CT方法。由表1可见，模型组Fbw7 mRNA水平（0.65±0.35）明显低于对照组（P＜0.01）。

    n△Ct

    (Ct,目的基因

    -Ct,内参基因)△△Ct

    （△Ct，模型组

    -△Ct，对照组）2-△△CT

    （模型组目的

    基因量对对

    照组倍数）152.16±0.7701模型组152.93±0.580.77±0.600.65±0.35*

    *P＜0.01 vs　对照组大鼠酒精性脂肪肝中Fbw7蛋白表达

    1:对照组

    2:模型组

    Fig.2  Expression of Fbw7 protein of alcoholic fatty liver in rats

    1: Control group

    2: Model group

    2.5  甘油三酯含量与Fbw7基因及蛋白含量的相关性  甘油三酯含量与Fbw7基因经相关分析，相关系数为ｒ=-0.601，P＜0.01，见图3。甘油三酯含量与Fbw7蛋白含量相关系数为ｒ=-0.892，P＜0.01，见图4。Fbw７基因及蛋白相关系数为ｒ=0.560，P＜0.01，见图5。

    3  讨  论

    蛋白质是生命活动的基本功能分子，细胞内的蛋白质处于合成与降解的动态平衡。蛋白质的降解对于细胞的生存及自我修复至关重要。Aaron、Avram和Irwin 3位科学家因共同发现了泛素调节的蛋白质水解作用而分享2004年诺贝尔化学奖。UPS是细胞质和细胞核内依赖于ATP、非溶酶体途径的蛋白质降解通路。UPS途径不仅能降解变性的、异常的或起短暂作用的蛋白质,而且能降解植物色素、转录因子、内膜蛋白和细胞周期蛋白等天然蛋白质,因而在转录水平的调节、蛋白质的降解、蛋白质稳定状态的调节、程序性细胞死亡、细胞周期的控制和胁迫响应等过程中起重要作用。UPS的过程是以共价键形式联结多个泛素分子,形成靶蛋白多聚泛素链即泛素化后,再输送到蛋白酶体上被消化降解。在该途径中, 泛素连接酶(ubiquitin ligase enzymes,E3)是通过识别和结合特异的靶蛋白序列或降解决定子来特异性地调节靶蛋白的降解代谢，是研究的重点。

    Fbw7是一种Fbox蛋白，与Skpl、Rbxl、Cul1共同组成一种重要的E3。Fbw7含色氨酸-天冬氨酸重复序列，可特异性识别底物，水解多种蛋白。Fbw7在细胞周期调控及多种肿瘤发生中发挥重要的作用，如乳房癌、子宫内膜癌、卵巢癌、结肠癌等［57］,可作为一种肿瘤抑制因子，其缺失常导致基因的不稳定。本实验运用实时荧光定量PCR技术和Westernblot检测了大鼠酒精性脂肪肝模型中Fbw7的mRNA及蛋白含量变化，结果显示，模型组肝组织中Fbw7的mRNA及蛋白含量减少，对照组与模型组之间差异有统计学意义（P＜0.01），进一步研究结果显示，Fbw7的mRNA及蛋白与肝脂肪化的血清学指标TG均成负相关（P＜0.01），说明Fbw7与酒精性脂肪肝的发病机制有密切关系。

    SREBPs是Fbw7的一个特异性底物，与酒精性脂肪肝的形成关系密切。 SREBPs是位于内质网上的膜结合蛋白，属于核转录因子家族，具有高保守的“碱性区-螺旋-环-螺旋-亮氨酸锌指”（basic helixhoophelixleucine Zipper,bHLHZip）结构。它首先合成结合于内质网的无活性的前体，相对分子质量为125?kDa,约1?150个氨基酸，经活化形成68?kDa的成熟SREBPs，该片段进入细胞核内与其靶基因启动子的固醇调节元件或E盒结合,调节相关基因的表达。SREBPs有3种同工酶：SREBP1a、SREBP1c和SREBP2。SREBP1主要调节脂肪酸和甘油三酯的生物合成中的酶，如乙酰CoA羧化酶、脂肪酸合成酶、硬脂酰CoA脱饱和酶和甘油3磷酸乙酰转移酶。SREBP2主要调节胆固醇生物合成中的酶，如 HMGCoA合成酶、HMGCoA还原酶、法尼醇二磷酸盐合成酶和角鲨烯合成酶，SREBPs加强低密度脂蛋白(lowdensity lipoprotein, LDL)受体的转录,介导胆固醇从血浆脂蛋白的吸收［89］。在酒精性脂肪肝中，酒精促进SREBP1c的表达, 增加生脂酶的基因转录，造成脂质堆积，形成酒精性脂肪肝。

    本实验结果表明，酒精性脂肪肝中SREBP1c的增加，可能部分由于酒精通过多种途径导致SREBPs合成增加［1011］，部分通过减少Fbw7的mRNA和蛋白含量，进而影响UPP对Fbw7的底物SREBPs的识别和降解，从而造成SREBPs含量增加，促进其转录因子的作用，使多种生脂酶转录增加，导致脂质堆积，形成脂肪肝。

    综上所述，本实验首次研究酒精性肝病中Fbw7的mRNA及蛋白含量变化，加深对UPS及SREBPs的了解，结果显示，酒精可减少Fbw7的基因及蛋白表达，降低了UPS对SREBPs识别和降解，增加SREBPs含量，促进脂肪生脂酶转录，导致脂质堆积，形成酒精性脂肪肝。因此，对Fbw7的研究可以在分子水平探讨脂肪肝的发病机制，进而为临床治疗开辟新的途径。酒精除影响Fbw7的含量，是否还影响Fbw7与SREBPs之间相互作用及SREBPs的磷酸化状态，尚待研究。

【参考文献】［1］ You M, Crabb D W. Recent advances in alcoholic liver disease II. Minireview: molecular mechanisms of alcoholic fatty liver［J］. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol, 2004, 287(1):16.

［2］ Punga T, BengoecheaAlonso M T, Ericsson J. Phosphorylation and ubiquitination of the transcription factor sterol regulatory elementbinding protein1 in response to DNA binding［J］. J Biol Chem, 2006, 281(35):2527825286.

［3］ Sundqvist A, BengoecheaAlonso M T, Ye X, et al. Control of lipid metabolism by phosphorylationdependent degradation of the SREBP family of transcription factors by SCF(Fbw7)［J］. Cell Metab, 2005, 1(6):379391.

［4］ Jin J, Cardozo T, Lovering R C, et al. Systematic analysis and nomenclature of mammalian Fbox［J］. Genes Dev， 2004, 18(21):25732580.

［5］ Anzi S, Finkin S, Shaulian E. Transcriptional repression of cJun′s E3 ubiquitin ligases contributes to cJun induction by UV［J］. Cellul Signall, 2008, 20(5)：862871.

［6］ Yan T Q, Wunder J S, Gokgoz N, et al. hCDC4 variation in osteosarcoma［J］. Cancer Genetics Cytogenetics, 2006, 169(2)：138142

［7］ Kwak E L, Moberg K H, Wahrer Doke C R, et al. Infrequent mutations of Archipelago (hAGO, hCDC4, Fbw7) in primary ovarian cancer［J］. Gynecol Oncol, 2005, 98(1)：124128.

［8］ Horton J D, Goldstein J L, Brown M S. SREBPs: activators of the complete program of cholesterol and fatty acid synthesis in the liver［J］. J Clin Invest，2002, 109(9)：11251131.

［9］ Matsuda M, Korn B S, Hammer R E, et al. SREBP cleavageactivating protein (SCAP) is required for increased lipid synthesis in liver induced by cholesterol deprivation and insulin elevation［J］. Genes Dev, 2001, 15(10):12061216.

［10］ Zhou G, Myers R, Li Y, et al. Role of AMPactivated protein kinase in mechanism of metformin action［J］. J Clin Invest, 2001, 108(8):11671174.

［11］ Xu A, Wang Y, Keshaw H, et al. The fatderived hormone adiponectin alleviates alcoholic and nonalcoholic fatty liver diseases in mice［J］. J Clin Invest, 2003, 112(1):91100.