慢性乙型肝炎外周血自然杀伤细胞的变化及其与HLACw基因型的关系
发表时间：2009-06-25 浏览次数：683次
作者：李海英 作者单位：山东大学医学院， 济南 250012
【摘要】 目的 探讨慢性乙型肝炎外周血自然杀伤细胞（NK细胞）和活化NK细胞数量的变化及其与HLACw基因型的关系。方法 采用流式细胞术检测30例急性乙型肝炎发病期患者、51例慢性乙型肝炎患者及41例正常对照外周血NK细胞和活化NK细胞的数量，并通过序列特异性寡核苷酸分型(PCRSSO)技术进行HLACw的基因分型。结果 急性肝炎组的NK细胞和活化NK细胞的数量均较正常对照组增高［(22.62±3.70)% vs (19.03±4.91)%,(65.28±14.45)% vs (53.88±14.01)%,P＜0.05］,慢性乙型肝炎组的NK细胞和活化NK细胞的数量均较正常对照组降低［(14.36±1.07)% vs (19.03±4.91)%,(47.14±5.67)% vs (53.88±14.01)%,P＜0.05］，且急性肝炎组与慢性乙型肝炎组间差异有统计学意义（P＜0.01）；急性肝炎组与正常对照组间HLACw位点各等位基因的基因型无统计学差异（P＞0.05），HLACw*03在慢性乙型肝炎组中基因频率明显高于正常对照组（P＜0.05），且与活化NK细胞数量呈显著负相关（γ=-0.394，P＜ 0.05）。结论 慢性乙型肝炎患者NK细胞功能低下，HLACw*03基因型可能是通过影响NK细胞而导致HBV感染持续存在的原因之一。
【关键词】 杀伤细胞 天然 肝炎 乙型 慢性 人类白细胞抗原 基因型
alleles in chronic hepatitis B patients
LI Haiying1， JIANG Xuemei2， CHEN Shijun2
(1. School of Medicine, Shandong University， Jinan 250012， China；
2. Department of Hepatic Diseases， Jinan Hospital for Infection Diseases， Jinan 250021， China)
To investigate the correlation between the frequency of circulating natural killer cells (NK cells)and HLACw alleles. Methods 30 patients with acute hepatitis B in nonage and 51 patients with chronic hepatitis B were included in the experimental groups， and 41 healthy individuals were enrolled as controls． Numbers of circulating NK cells and activated NK cell were analyzed by flow cytometry． HLACw genotyping was conducted by the polymerase chain reaction sequence specific oligonucleotide (PCRSSO) method. Results Numbers of circulating NK cells and activated NK cell in acute hepatitis B patients were higher than in healthy subjects［(22.62±3.70)% vs (19.03±4.91)%, and (65.28±14.45)% vs (53.88±14.01)%, both P＜0.05］， however, those in patients with chronic hepatitis B were lower than in healthy subjects［(14.36±1.07)% vs (19.03±4.91)%, and (47.14±5.67)% vs (53.88±14.01)%, both P＜0.05］, there were statistically significant differences between the groups of chronic hepatitis B and acute hepatitis B（P＜0.01）. There was no statistical significance between the groups of acute hepatitis B and healthy subjects about HLACw（P＞0.05. HLACw*3 was more frequent in patients with chronic hepatitis B than in controls (P＜0.05)， and there was a significantly negative correlation between the frequency of HLACw*03 and the numbers of activated NK cell in the group of chronic hepatitis B（γ=-0.394, P＜ 0.05）. Conclusions
近年研究证实,获得性免疫系统在乙型肝炎的发病机制中起重要作用，其中自然杀伤细胞(natural killer cells ,NK)是获得性细胞免疫的核心调节细胞，它能通过产生细胞因子和细胞毒性作用两种方式暂时控制感染并使感染尽量局限，以待获得性免疫反应形成，彻底清除病毒［1］。
有关人类白细胞抗原(HLA)Cw在丙型肝炎病毒感染、移植和肿瘤等方面的研究较多，Thio等［2］研究发现,对于急性丙型肝炎病毒(HCV)感染, HLACw*04是KIR配体，两者相互识别可影响NK细胞的功能。有关乙型肝炎尤其是慢性乙型肝炎患者，NK细胞与HLACw的关系已成为人们进行乙肝防治研究的热点。本实验以健康人作为对照，对急、慢性乙型肝炎患者外周血NK细胞和活化NK细胞的数量及HLACw基因进行了检测，旨在探讨NK细胞及HLACw基因在慢性乙型肝炎中的意义。
1 资料与方法
1.1 临床资料与分组 选择2006年10月～2007年7月在济南市传染病医院住院的急、慢性乙型肝炎患者，诊断均符合2000年修订的《病毒性肝炎防治方案》的诊断标准［3］，排除患有重型肝炎、肝硬化、肝癌及合并其他病毒性肝炎和免疫性疾病。入选者均为汉族，籍贯为山东。急性乙型肝炎发病期患者30例(急性肝炎组)，女7例，男23例，20～50岁；慢性乙型肝炎患者51例(慢乙肝组)，女12例，男39例，23～55岁。正常对照41例(正常对照组)，来自济南市传染病医院查体中心查体的无血缘关系的健康人群，其性别比率与肝炎患者比较无统计学差异（P＜0.05）。
1.2 主要试剂 荧光标记鼠抗人单抗(CD3-CD16+CD56+、HLADR)均购自美国BD公司，Biosynthesis DNA提取试剂盒购自Gentra公司，HLACw位点等位基因序列特异性引物（上游引物5′AGC GAG GTG CCC GCC CGG CGA3′、下游引物5 ′GGA GAT GGG GAA GGC TCC CCA CT3′）、Master Mix(PCR引物、Taq DNA聚合酶、磷酸盐缓冲液及dNTPs)及RELISSO分型Kit均由挪威Dynal Biotech ASA提供。
1.3 主要仪器 FACS calibur流式细胞仪系美国BD公司产品，PAC200电泳仪器及Gel Doc2000 UV照相系统系美国BIORAD公司产品，9700基因扩增仪系美国ABI公司产品。
1.4 一般生化指标的检测 病例及对照均经雅培Architect ci8200生化免疫联体机检测HBsAg、抗HBs、HBeAg、抗HBe、抗HBcIgM，IgG（检测试剂为雅培原装配套试剂），并排除其它型肝炎病毒感染。
1.5 NK细胞的检测 采集入选者和对照组肝素抗凝外周血2?mL，在采集后6?h之内进行外周血NK细胞检测。检测方法如下：新鲜抗凝全血100?μL，先用鼠抗人单抗CD3-CD16+CD56+10?μL和HLADR 5?μL标记细胞，避光孵育15?min后，加溶血素溶解红细胞10?min，然后1?000?r／min离心5?min，弃上清，加鞘液2?mL再以1?000?r／min离心5?min，弃上清，用1%多聚甲醛固定后24?h内上流式细胞仪检测，用Cellquest软件分析。
1.6 HLACw基因分型的检测 采用序列特异性寡核苷酸分型(PCRSSO)［4］，应用Dynal PCRSSOHLA结果分析软件系统判定结果。
1.7 统计学处理 所有数据录入Excel表格，用SPSS11.5软件进行t检验、χ2检验或Fisher确切概率法及线性相关分析，P＜ 0．05为差异有统计学意义。
2 结 果
2.1 乙型肝炎患者外周血NK细胞、活化NK细胞数量的变化 与正常对照组相比，慢性乙型肝炎组的NK细胞、活化NK细胞的数量均降低（P＜0.05），急性肝炎组的NK细胞、活化NK细胞的数量均增高（P＜0.05）,且急性肝炎组与慢性乙型肝炎组间差异有统计学意义（P＜0.01），见表1、图1。
2.2 急、慢性乙型肝炎患者与正常对照之间HLACw各等位基因表型频率的检测结果 慢性乙型肝炎组HLACw*03等位基因频率较正常对照组明显升高（P＜0.05)，HLACw其他等位基因在两组之间差异无统计学意义（P＞0.05），见表2。急性肝炎组与正常对照组间HLACw位点各等位基因的基因型无统计学差异（P＞0.05），见表3,图2。
2.3 HLACw*03等位基因与NK细胞的关系 经线性相关分析发现，慢性乙型肝炎组外周血活化NK细胞数量与HLACw*03等位基因频率呈显著负相关,γ=-0.394，P＜0.05。抗原
3 讨 论
乙型肝炎病毒(HBV)感染后所出现的急性自限性感染、迁延不愈的慢性感染或重型肝炎等临床类型，除与感染HBV的时机、HBV基因型、HBV变异等因素相关外［5］，其发病机制和病情进展还与机体的免疫功能有关。NK细胞表面受体分为激活性受体和抑制性受体，与MHCI类分子结合的是抑制性受体，所以NK细胞杀伤的对象主要是MHCI类分子表达下调的细胞，即著名的“丢失自我”假说。该假说认为,NK细胞的反应是由抑制性受体和激活性受体传人信号综合的结果来决定的［6］。当NK细胞遇到由于病毒感染而高表达激活性配体的细胞时，NK细胞的反应取决于与MHCI类分子结合的抑制性受体信号的强弱。对于MHCI类分子表达下调的病毒感染细胞，会遭受强烈的NK细胞攻击，而细胞毒T淋巴细胞(CTL)正是依赖MHCI类分子发挥作用的，所以，NK细胞可以覆盖CTL所不能涉及的免疫盲区［7］。本研究结果显示,与正常对照组比较，慢性乙型肝炎组NK细胞和活化NK细胞数量下降，急性肝炎组NK细胞和活化NK细胞数量升高，且急性肝炎组与慢性乙型肝炎组间比较有统计学意义，提示，NK细胞缺陷的患者易发生HBV持续存在，可能与NK细胞及活化NK细胞缺乏导致其与CTL之间无法形成功能互补有关。因此NK细胞缺陷可能与HBV感染后慢性化相关。
HLA复合体作为调节机体免疫应答的重要基因群,与抗HBV免疫反应有着密切的关系，较弱的免疫反应是造成HBV感染慢性化的原因之一，某些特殊的HLA基因型可能影响着免疫反应的强弱和HBV感染的慢性化［8］。本研究结果显示,HLACw*03在慢性乙型肝炎组的等位基因频率明显升高，急性肝炎组与正常对照组间的HLACw位点各等位基因的基因型无统计学差异，提示，携带HLACw*03基因位点的宿主感染HBV后,不易及时清除HBV,倾向于感染慢性化。
HLACw可作为NK细胞免疫球蛋白样受体(KIR)的配体在免疫调节中发挥作用。KIR分子属于免疫球蛋白样超家族,表达于NK细胞和部分T细胞表面,可分为刺激性KIR(sKIR)和抑制性KIR(iKm)。NK细胞在抗病毒固有免疫应答中的反应与其表面激活性及抑制性受体的平衡表达有关。它们分别传递活化信号和抑制信号，二者协同作用激活或抑制NK细胞的功能［910］，不同个体的HLACw与相应的sKIR或iKm的组合形式存在差异，这种差异导致个体间NK细胞功能不同，其中包括活化NK细胞数量的差异。本研究结果显示，活化NK细胞数量与HLACw*03等位基因频率呈显著负相关,由此推测，HLACw*03基因型可能是通过影响NK细胞抗病毒作用而导致HBV感染持续存在的原因之一。
【参考文献】［1］ Luca G G， Francis V C． Noncytolytic control of viral infections by the innate and adaptive immune response［J］． Annu Rev Immunol， 2001， 19(3)：6591．
［2］ Thio C L， Gao X， Goedert J J， et al． HLACw*04 and hepatitis C virus persistence［J］． J Virol， 2002， 76(10)：47924797．
［3］ 中华医学会传染病与寄生虫病学分会、肝病学分会、病毒性肝炎防治方案［J］.中华传染病杂志，2001， 19(1)：5662.
［4］ 李维，张敏芳，田晓峰．HLA分型基因微阵列的构建及与PCRSSO、PCRSSP、SBT的比对［J］．中华临床医学卫生杂志，2005，3(11)：1115．
［5］ 骆抗先主编．乙型肝炎基础与临床［M］．第3版．北京：人民卫生出版社，2006：395407．
［6］ Lanier L I． NK cell recognition［J］． Annu Rev lmmuno1， 2005， 23（4）：225274．
［7］ 田志刚．NK细胞新理论对重大疾病的新解释［J］．中国免疫学杂志，2OO2，18(2)：7578．
［8］ Nozoe T, Korenaga D, Futatsugi M, et al. Immunohistochemical expression of Creactive protein in squamous cell carcinoma of the esophagussignificance as a tumor marker［J］. Cancer Lett, 2003, 192(1)：8995.
［9］ Norris S， Doherty D G， Curry M， et al． Selective reduction of natural killer cells and T cells expressing inhibitory receptors for MHC class I in the livers of patients with hepatic malignancy［J］． Cancer Immunol Immunother， 2003， 52(1)：5358．
［10］ Kogure T， Mantani N， Goto H， et al． The effect of interleukin15 on the expression of killercell immunoglobulinlike receptors on peripheral natural killer cells in human［J］． Mediators Inflamm， 2002， 11(11)：219224．
