RNA干扰研究进展及其在医学中的应用前景

　　作者：高利利 吴本俨 王孟薇

　　作者单位:100853北京解放军总医院南楼消化科

　　【关键词】 RNA干扰

　　随着人类基因组计划的实施，人类已积累了大量的基因序列数据，而这些序列大部分缺乏明确的功能注释。目前随着后基因组时代的到来，基因功能的研究已变得日益重要。RNA干扰(RNA interference，RNAi) [1] 是由与靶基因序列同源的双链RNA(double-stranded RNA，dsRNA)所诱导的一种特异性的转录后基因沉默现象(post-transcriptional gene silencing，PTGS)。它不同于基因敲除(Gene knock-out)使目标基因永久性的表达沉默，而是通过降解具有同源序列靶基因的mRNA，达到阻止基因表达的作用，因此被形象地称为“基因敲低”(Gene knock-down)。

　　1 RNAi的发现过程

　　1995年，Guo等 [2] 利用反义技术研究线虫的基因功能时，发现靶向Par-1的反义RNA可以阻遏该基因的表达，但正义链的导入亦可出现类似现象，据此推测正义链对基因表达有一定的作用，并提出RNAi现象。1998年Fire等 [1] 将靶向Par-1基因的dsRNA的正反义链混合物注入线虫卵中，发现dsRNA抑制靶基因表达的能力至少比任一单链RNA强10倍以上，靶mRNA受到明显的干扰且呈现出可传递给后代的特异表型，因而他们提出了“dsRNA介导的RNA干扰”现象。2000年，Zamore等 [3] 发现:注入果蝇胚胎细胞的dsRNA被切割为21～23nt大小的RNA片段，而同源的内源mRNA只有与dsRNA对应的部位被切割。从而确定基因沉默发生在转录后水平。

　　这种同源降解机制在果蝇、真菌、拟南芥、斑马鱼、小鼠中均存在，说明它在生物中具有普遍性，这些由dsRNA介导的序列特异性基因沉默过程，可能是生物在长期进化过程中形成的一种自我保护机制，以降低病毒感染和转座子插入对基因的毒性作用 [4] 。

　　2 RNAi的发生机制

　　RNAi已经作为剔除基因功能的工具，在基因功能研究中得到广泛的应用，但RNAi的机制目前还没有完全清楚。RNAi的发生可归纳为以下几步:(1)细胞内形成dsRNA;(2)dsRNA被核酸酶(Dicer)切割成21～25nt的干扰性小RNA(siRNA);(3)由siRNA中的反义链指导形成一种核蛋白体，称RNA诱导的沉默复合体(RNA-induced silencing complex，RISC);(4)由RISC介导切割靶mRNA分子中与siR-NA反义链互补的区域，使转录后的mRNA不能翻译成蛋白质;(5)再以靶mRNA为模板，以siRNA为引物，在RNA依赖的RNA合成酶(RdRP)的作用下产生新的dsRNA，进行下一个循环的RNAi，从而使同源基因表达沉默。

　　虽然RNAi现象在许多生物中自然存在，但是在哺乳动物细胞中至今未发现有RNAi自然存在的证据。把长度超过30个核苷酸的dsRNA转染进入大多数哺乳动物细胞中后，会导致基因表达非特异性抑制 [5] 。可能的机制是，哺乳类动物细胞中可能还存在着dsRNA依赖性蛋白激酶(dsRNA dependent protein kinase，PKR)和2'，5'寡腺苷酸合成酶腺苷酸聚合酶 [6，7] 。长链dsRNA进入细胞后，细胞内的病毒防御机制被激活。细胞内干扰素产生增加，蛋白激酶PKR被激活，活化的PKR进一步使翻译起始因子EIF2α磷酸化失活，最终造成翻译的停滞;2'，5'寡腺苷酸聚合酶是非特异性核糖核酸酶RNaseL的辅因子，长链dsRNA激活2'，5'寡腺苷酸聚合酶，然后RNaseL又导致非特异性RNA降解。

　　3 RNAi的特点

　　由极少的dsRNA就可以引起明显的基因敲除表型，由此可见RNAi具有特异性和高效性两个明显的特征。

　　当一段基因同源的dsRNA注入动物的胚胎时，它可以特异地在体内干扰相应基因的表达，其它基因即使与靶基因同属于一个基因家族都不会受到干扰。而且，在siRNA序列中配对的19、21nt中如果只改变一个核苷酸，就可以使该siRNA序列不对靶mRNA起作用，证明RNAi有高度特异性的。

　　RNA干扰作用具有很强的潜能，每个细胞只需要几个dsRNA就可以产生有效的干扰作用，尽管注入的dsRNA的浓度远远低于体内同源的mRNA水平，它却足以引起RNA干扰作用。可见，RNAi过程具有生物催化反应的高效性。

　　4 产生RNAi的方法

　　产生RNAi的方法主要有体外合成和体内合成siRNA法。Harborth等 [8] 设计体外合成21nt siRNA的方法是:在基因库中寻找靶向基因的mRNA序列，并从起始密码后的第75位碱基开始寻找AA+N19+UU序列或AA+N19序列，其中N19为任意19nt的mRNA核苷酸序列;然后设计选定序列中的G+C的比例为30%～70%;对确定的序列用Blast搜寻EST基因库，确定所靶向的基因是唯一的。

　　目前已经有多家公司可以提供siRNA化学合成服务，比较著名的有Dharmacon(www.dharmacon.com)、Qiagen(www.giagen.com)、Proligo(www.proligo.com)和Ambion(www.ambion.com)等。厂家可进行siRNA序列设计和合成，QIA-GEN公司根据现有的研究结果和客户的反馈意见，认为mRNA21个碱基中G/C含量应为50%，这比确定AA起始序列更重要。另外序列中应该避免连续同时出现3个鸟嘌呤碱基对，多个G序列重叠形成的多聚体将大大减弱siR-NA的阻断作用。

　　由于体外合成siRNA在细胞内的作用，受到转染技术和效率的影响，另外体外合成siRNA易于被RNA酶分解，而且不论是生物合成还是化学合成dsRNA，成本均较高且费时，在细胞内合成siRNA诱导RNAi的技术，大大削减了实验成本，增加了实验的可操作性。Miyagishi等 [9] 建立了U6启动子驱动的体内siRNA合成方法，成功地抑制了靶基因在哺乳动物细胞中的表达。Brummelkamp [10] 等构建了pSU PER质粒载体，应用了聚合酶ⅢH1RNA基因启动子起始RNA的合成。为了进一步方便siRNA的导入，研究者们又在siRNA质粒载体的基础上发展了通过腺病毒、逆转录病毒和慢病毒载体导入siRNA的技术。用逆转录病毒和腺相关病毒等做载体。其作用原理是类似的，都是携带启动子和DNA模板，在细胞内指导合成siRNA。所不同的是病毒载体介导的siRNA合成更快速、一致和稳定，即使在某些非分化、原代培养的细胞中，转染率也能达到100%。

　　5 RNAi在哺乳动物基因研究中的应用

　　至目前为止，RNAi体内实验已涉及了众多的靶基因，包括报告基因，如萤火虫荧光素酶、绿色荧光蛋白和黄色荧光蛋白;还有人类病毒基因，如人类丙型肝炎病毒(HCV)和人类乙型肝炎病毒基因(HBV);以及小鼠的内源性基因，如β葡萄糖醛酸酶基因、RasGAP、CD8、CD25和Fas等基因。大部分体内RNAi实验是在小鼠模型上进行的。

　　6 RNAi在医学上的应用前景

　　6.1 抗病毒治疗 由于RNAi是机体中古老而天然的抗病毒机制，HIV病毒感染是我们亟待解决的问题，将RNAi技术应用于艾滋病治疗是顺理成章之事。Doburn等 [11] 已证实siRNA双链可以结合HIV-1基因组中的Tat和Rev调节基因，特异地阻断Tat和Rev蛋白的表达和功能，从而抑制HIV-1基因在人类T细胞和初级淋巴细胞中表达和复制。同时，Capodici等 [12] 也证实了由21b pdsRNA介导的特异性RNAi可以抑制永久细胞系和初级CD4 + T细胞感染HIV-1。当HIV-1病毒感染在进行中，siRNA能结合HIV-1进入细胞的受体，从而阻止HIV-1感染，甚至RNAi还能降低病毒在细胞内复制。第一次证明通过沉默CD4表达可以阻止HIV-1感染 [13] 。

　　6.2 抗肿瘤治疗 多种癌基因可以作为靶点设计相对应的siRNA [14] 。Brummelkamp等 [15] 用逆转录病毒载体将siR-NA导入肿瘤细胞中，特异性抑制了癌基因KRAS(V12)的表达。对急性髓性白血病的研究已经取得了乐观的结果。Scherr等 [16] 以引起慢性髓性白血病和bcr abl阳性急性成淋巴细胞白血病的bcr abl癌基因为靶基因，设计了对应的siRNA，并获得了87%的有效抑制率。Wilda等 [17] 用siRNA抑制白血病BCR/ABL融合基因表达也取得了成功。

　　7 结语

　　RNA干扰已经成为在哺乳动物细胞中抑制特定基因表达的有力工具。但是，siRNA在哺乳动物细胞中介导基因静默是通过干扰mRNA的稳定性，还是在翻译或转录水平起作用，目前还不是很清楚，需要进一步阐明具体的分子机制。该技术在哺乳动物基因功能的研究，甚至人类疾病的治疗中将具有重要的应用前景。

　　参考文献

　　1 Fire A，Xu S，Montgomery MK，et al.Potent and specific genetic inter-ference by double-stranded RNA in Caenorhabdits elegans.Nature，1998，391:806-811.

　　2 Guo S，Kemphues KJ.Par-1.a gene required for establishing polarity inC.elegans embryos，encodes a putative Ser/Thr kinase that is asym-metrically distributed.Cell，1995，81:611-620.

　　3 Zamore PD，Tuschl T，Sharp PA，et al.RNAi:double-stranded RNA directs the ATP-dependend cleavage of mRNA at21to23nucleotide intervals.Cell，2000，101:25-33.

　　4 Hammon GJ.RNA interference.Nature，2002，418(6894):244-251.

　　5 Der SD，Yang YL，Weissmann C，et al.A double-stranded RNA-acti-vated protein kinase-dependent pathway mediating stress-induced apoptosis.Proc Natl Acad Sci USA，1997，94(7):3279-3283.

　　6 Paddison PJ，Caudy A，Hannon GJ.Stable suppression of gene expression by RNAi in mammalian cells.Proc Natl Acad Sci USA，2002，99(3):1443-1448.

　　7 Terenzi F，De Veer MJ，Ying H，et al.The antiviral enzymes PRK and RNase L suppress gene expression from viral and non-viral based vec-tors.Nucleic Acids Res，1999，27(22):4369-4375.

　　8 Harborth J，Elbashir SM，Bechert K，et al.Identification of essential genes in cultured mammalian cells using small interfering RNAs.J Cell Sci，2001，114:4557-4565.

　　9 Miyagishi M，Taira K.U6promoter-driven siRNAs with four uridine3'overhangs efficiently suppress targeted gene expression in mammalian cells.Nat Biotech，2002，19:497-500.

　　10 Brummelkamp TR，Bernards R，Agami R.A system for stable expres-sion of short interfering RNAs in mammalian cells.Science，2002，296:550-553.

　　11 Doburn GA，Cullen BR.Potent and specific inhibition of human im-munodeficiency virus type1replication by RNA interference.J Virol，2002，76(18):9225-9231.

　　12 Capodici J，Kariko K，Weissman D.Inhibition of HIV-1infection by small interfering RNA-mediated RNA interference.J Immunol，2002，169(9):5196-5201.

　　13 David L.RNAi could hold promise in the treatment of HIV.Lancet，2002，359(9322):2007-2009.

　　14 Rye PD，Stigbrand T.Interferingwith cancer a brief outline of advances in RNA interference in oncology.Tumour Biol，2004，25(5):329-336.

　　15 Brummelkamp TR，Bernards R，Agami R.Stable suppression of tumori-genicity by virus-mediated RNA interference.Cancer Cell，2002，2(3):243-247.

　　16 Scherr M，Battmer K，Winkler T，et al.Specific inhibition of bcrabl gene expression by small interfering RNA.Blood，2003，101(4):1566-1569.

　　17 Wilda M，Fuchs U，Wossmann W，et al.Killing of leukemic cells with a BCR/ABL fusion gene by RNA interference(RNAi).Oncogene，2002，21(37):5716-5724.