胃腺癌组织中微淋巴管密度的检测及其临床病理意义

    作者：孙薇，周晓军，马恒辉，章如松，陆珍凤    作者单位：南京大学医学院临床学院 南京军区南京总医院病理科     【摘要】  目的 探讨原发性胃腺癌中微淋巴管密度的临床病理意义。方法 应用单克隆抗体D240检测原发性胃腺癌组织周边区和中心区及其正常胃组织中微淋巴管密度（LMVD），分析其与淋巴管浸润、淋巴结转移及其他临床病理参数之间的关系。结果 胃腺癌周边区LMVD明显高于中心区LMVD（P＜0.05）和正常胃组织LMVD（P＜0.05），且淋巴管为功能性的。周边区LMVD与肿瘤的Ming分型、淋巴管浸润及淋巴结转移密切相关（P＜0.05），而与患者的年龄、性别、肿瘤的分化程度及浸润程度无关（P＞0.05）。中心区LMVD与这些临床病理参数之间均无相关性（P＞0.05）。结论 原发性胃腺癌癌周LMVD和淋巴管浸润、淋巴结转移密切相关，检测癌周LMVD是预测胃癌淋巴结转移的有效指标之一，有助于判断胃癌的预后。

    【关键词】  胃癌；微淋巴管密度；D240；淋巴结转移

    Detection of Lymphatic Microvessel Density in Primary Gastric Adenocarcinoma and Its Clinicopathological Significance

    SUN Wei，ZHOU Xiaojun，MA Henghui，ZHANG Rusong，LU Zhenfeng

    Clinical School of Medical College, Nanjing University/Department of Pathology, Nanjing General Hospital of Nanjing Military Command, Nanjing 210002, China

    Corresponding Author: ZHOU Xiaojun, Email: zhouxj1@yahoo.com.cnAbstract：Objective   To investigate the clinicopathological significance of the lymphatic microvessel density (LMVD) in primary gastric adenocarcinoma.Methods  Monoclonal antibody D240 was used immunohistochemically to detect the lymphatic microvessel density(LMVD) in the intra and peritumoral areas of the primary gastric adenocarcinoma and normal gastric tissue, and analysis the relationship among the lymphatic microvessel density(LMVD), lymphatic invasion, lymph node metastasis and other clinicopathological parameters of the primary gastric adenocarcinoma.Results  LMVD of the peritumoral area was significantly higher than that of intratumoral area and nomal tissue(P＜0.05). LMVD of the peritumoral area was significantly associated with Ming Classification, lymphatic invasion and lymph node metastasis(P＜0.05), while less associated with age, sex, differentiation and invasion of the tumor(P＞0.05). LMVD of the intratumoral area was not correlated with these clinicopathological parameters(P＞0.05).Conclusion  LMVD of the peritumoral area was significantly associated with lymphatic invasion and lymph node metastasis, and detection of LMVD in peritumoral area can be used for prediction of lymph node metastasis.

    Key words：Gastric carcinoma; Lymphatic microvessel density; D240; Lymph node metastasis

胃癌是世界上发生率和死亡率很高的恶性肿瘤之一，严重威胁人类生命健康。即使手术全切除肿瘤组织，长期生存率也难以令人满意，其重要原因之一就是肿瘤组织发生了淋巴转移。以前由于缺乏淋巴管内皮细胞的特异性标记物，对肿瘤淋巴转移的研究一直进展缓慢。单克隆抗体D240是新近发现的淋巴管内皮细胞特异性标记物[1]。本文采用免疫组化EnVision法，应用D240检测69例原发性胃腺癌中微淋巴管密度（Lymphatic microvessel density, LMVD），分析其临床病理意义，探讨肿瘤淋巴管形成在胃腺癌发展中的作用。

    1  材料与方法

    1.1  材料

    69例原发性胃腺癌标本来自南京军区南京总医院病理科2004年9月至2006年10月间存档蜡块。所有病例都实施了胃切除术和淋巴结剥离，术前未接受放射治疗或化学治疗。其中男性50例，女性19例，年龄35～80岁，平均58.71岁。病理分型依据Ming分型。有淋巴结转移的25例，无淋巴结转移的44例，且根据国际抗癌联盟、美国分期和预后委员会（UICC/AJCC）1997年第五版规定，每例剥离的淋巴结数目均不少于15个。另取26例胃远端切缘作为正常胃组织。

    1.2  方法

    采用免疫组织化学EnVision法。抗体来源：D240（克隆号D240）为美国Dako公司产品，EnVision试剂盒购于美国Dako公司。操作步骤按照试剂盒说明书进行。用PBS代替一抗作空白对照。中性树胶封固，镜下观察。

    1.3  结果判断

    D240定位于淋巴管内皮细胞，以胞浆的棕黄色颗粒样着色为阳性。微淋巴管密度计数采用Weidner等[2]报道的方法，先在低倍镜（×40）下观察肿瘤周边区（peritumoral region）、肿瘤中心区（intratumoral region）及相应远端切缘正常组织，选择其中淋巴管高密度区（hot spots），然后在高倍镜（×200）下计数被染色的淋巴管数目。每个染成棕色的内皮细胞或内皮细胞簇，只要与邻近脉管、肿瘤细胞或其他结缔组织分开，即视为一个淋巴管。计数5个高倍视野下的淋巴管数目，取其平均值作为该例的LMVD。

    1.4  统计学方法

    数据采用SPSS11.5软件包分析，计量资料数据用均值±标准差（±s）表示，两个样本均数之间的比较采用t检验，三个样本均数之间的比较采用方差分析。所有假设检验采用双侧检验，检验水准α=0.05，以P＜0.05认为差异有统计学意义。

    2  结果

    2.1  淋巴管的形态特征

    D240阳性定位于淋巴管内皮细胞胞浆，为棕黄色颗粒。光镜下观察发现D240阳性的淋巴管呈扩张状或闭塞条索状，管壁为单层扁平上皮，较薄，管腔中无红细胞。而含有红细胞的脉管即血管染色为阴性，见图1a。正常胃组织淋巴管多呈扩张状，分布在胃组织各层中，以黏膜下层最多，数目较癌周减少。原发性胃腺癌组织周边区淋巴管数量较多，多呈扩张不规则形，见图1b，有时可见淋巴管内癌栓，见图1c，而在癌组织中心区，淋巴管数量明显减少，大多呈闭塞条索状，见图1d。

    2.2  LMVD的测定表1  原发性胃腺癌周边区LMVD和中心区LMVD与临床病理参数之间的关系胃腺癌癌周组织LMVD为5.60～16.40个，平均为10.83±3.08个，中心区LMVD为1.20～5.20个，平均为2.78±0.99个，正常胃组织LMVD为1.60～5.20个，平均为2.94±0.88个。周边区LMVD明显高于中心区和正常组织，差异有统计学意义（t=21.48, P＜0.05；t=12.82, P＜0.05）。中心区LMVD和正常组织比较，差异无统计学意义（t= 0.703, P=0.484）。

    2.3  胃腺癌周边区LMVD、中心区LMVD与临床病理参数之间的关系

    由表1可知，原发性胃腺癌周边区LMVD与肿瘤的Ming分型、淋巴管浸润及淋巴结转移密切相关（P＜0.05），而与患者的年龄、性别、肿瘤的分化程度及浸润程度无关（P＞0.05）。中心区LMVD与这些临床病理参数之间均无关（P＞0.05）。

    3  讨论

    肿瘤的侵袭和转移是癌症患者死亡的重要原因之一。胃癌早期以淋巴转移为主，淋巴转移也是评价胃癌分期和决定胃癌预后的关键因素之一。在发生淋巴结转移前，肿瘤细胞必须首先侵入淋巴系统。但肿瘤细胞是侵入肿瘤组织中已存在的淋巴管还是肿瘤诱导的新生淋巴管，以及这一过程是否和淋巴结转移相关目前还不清楚。

    以前由于缺乏淋巴管特异性的标记物，对肿瘤相关淋巴管生成的研究一直比较困难。先前报道的一些可标记淋巴管内皮细胞的免疫组化标记物，如LYVE1(lymphatic vessel endothelial receptor1)[3]、VEGFR3(vascular endothelial cell growth factor receptor3)[4]、Prox1(prosperorelated homeobox1)[5]等，只适用于冰冻切片，而且在随后的研究中也发现这些标记物对淋巴管的特异性较差，影响了对肿瘤淋巴管浸润机制的研究。单克隆抗体D240是新近发现的淋巴管内皮细胞标记物，大量研究表明其可用于检测石蜡切片上正常组织和肿瘤组织中的淋巴管内皮细胞，且具有很好的特异性和敏感性[1,6]。本实验应用D240单克隆抗体对原发性胃腺癌及其正常组织的淋巴管进行免疫组化检测，结果显示阳性脉管管壁薄、形状不规则、管腔内无红细胞，符合淋巴管的特征，而管壁较厚、管腔内含有红细胞的脉管即血管染色为阴性，证实了单克隆抗体D240是目前标记淋巴管内皮细胞的最佳标记物。

    经过对69例原发性胃腺癌癌组织中心区、周边区及其正常胃组织的微淋巴管数量和形态分析发现，癌组织周边区微淋巴管数目明显高于癌组织中心区和正常胃组织。淋巴管多呈扩张不规则形，且和淋巴管浸润、淋巴结转移密切相关，而在癌组织中心区，微淋巴管数量明显减少，多呈闭塞条索状，和淋巴管浸润及淋巴结转移无相关性。推测肿瘤中心区淋巴管为无功能性的，而周边区处于扩张状态的淋巴管为功能性淋巴管，在淋巴管浸润和淋巴结转移过程中发挥极其重要的作用，表明检测肿瘤周边区LMVD可以更加准确地预测肿瘤的淋巴结转移。Leu等[7]发现尽管肿瘤组织中存在促淋巴管生成的相关因子如VEGFC、VEGFR3等，但却无法形成功能性淋巴管，可能是由于肿瘤组织中心区淋巴管在不断分化增殖的肿瘤细胞产生的机械压力作用下发生塌陷、萎缩所致。

    根据胃癌的生长特点提出的Ming分型在一定程度上反应了肿瘤的某些生物学特性[8]。本实验研究结果提示，膨胀型胃癌组织周边区的微淋巴管数目和浸润型周边区微淋巴管数目差异有统计学意义。光镜下也观察到膨胀型胃癌组织周边区的淋巴管部分呈闭合状，而浸润型周边区的淋巴管多为扩张状，在中心区也存在少量扩张状态的淋巴管。这些呈扩张状的功能性淋巴管为肿瘤细胞的淋巴转移提供了有利的条件，推测可能是浸润型胃癌更容易发生淋巴结转移的原因之一。

【参考文献】[1] Kahn HJ, Bailey D, Marks A. Monoclonal antibody D240, a new marker of lymphatic endothelium, reacts with Kaposi’s sarcoma and a subset of angiosarcoma[J]. Mol Pathol, 2002, 15(4): 434440.

[2] Weidner N, Folkman J, Pozza F, et al. Tumor angiogenesis: a new significant and independent prognostic indicator in earlystage breast carcinoma[J]. J Natl Cancer Inst, 1992, 84(24):18751887.

[3] Skobe M, Hawighorst T, Jackson DG, et al. Induction of tumor lymphangiogenesis by VEGFC promotes breast cancer metastasis[J]. Nat Med, 2001, 7(2): 192198.

[4] Yonemura Y, Endo Y, Fujita H, et al. Role of vascular endothelial growth factor C expression in the development of lymph node metastasis in gastric cancer[J]. Clin Cancer Res, 1999, 5(7): 18231829.

[5] Parr C, Jiang WG. Quantitative analysis of lymphangiogenic markers in human colorectal cancer[J]. Int J Oncol, 2003, 23(2): 533539.

[6] Fukunaga M. Expression of D240 in lymphatic endothelium of normal tissues and in vascular tumours[J]. Histopathology, 2005, 46(4):396402.

[7] Leu AJ, Berk DA, Lymboussaki A, et al. Absence of functional lymphatics within a murine sarcoma: a molecular and functional evaluation[J]. Cancer Res， 2000, 60(16):43244327.

[8] Ming SC. Gastric carcinoma. A pathobiological classification[J]. Cancer, 1977, 39 (6):24752485.