人原发性胃恶性淋巴瘤裸小鼠原位移植模型的建立

人原发性胃恶性淋巴瘤裸小鼠原位移植模型的建立作者：脱帅 刘秋珍 张宁 朱希伟 王明耀　    作者单位：1 110003 沈阳，解放军第202医院普通肝胆外科； 2 110032 沈阳，辽宁省中医药大学    【摘要】  目的 为探讨胃恶性淋巴瘤的发病机制和治疗方法提供理想的动物模型。方法 采用人胃恶性淋巴瘤术中原发灶和肝转移灶新鲜瘤组织植入裸小鼠胃黏膜下层，观察原位移植成瘤率，移植瘤的侵袭和转移率，进行形态学、染色体核型和流式细胞分析。结果 13例人胃恶性淋巴瘤标本9例移植成功。依据WHO新分类标准，从中筛选出1株人胃原发性非霍奇金B细胞恶性淋巴瘤裸鼠原位移植肝转移模型HGBL9903，1株人胃原发性非霍奇金B细胞恶性淋巴瘤裸鼠原位移植模型HGBL9904和1株人胃原发性霍奇金B细胞恶性淋巴瘤裸鼠原位移植模型HGBL9902。免疫组织化学示CD19、CD20、CD22、CD45和CD79a均阳性。染色体众数范围75～87条，流式细胞分析示DI值1.23～1.47，均为异倍体。3株模型分别传至83代、87代和89代，共移植裸鼠785只；自第3代起肿瘤的移植生长率和液氮冻存复苏成活率均为100%。HGBL9903肝转移率为100%，脾转移率为36.7%，淋巴结转移率为57.6%。人胃恶性淋巴瘤在裸鼠胃壁内自主侵袭性生长，侵袭破坏胃壁各层组织结构。发生血液(肝，脾)转移，淋巴转移和腹腔内种植转移。结论 HGBL9904、HGBL9903和HGBL9902三株人胃原发性恶性淋巴瘤裸鼠原位移植模型，移植瘤的组织病理学、超微结构、DNA含量测定及染色体核型分析结果与来源人胃恶性淋巴瘤细胞相一致。完整的模拟了人胃恶性淋巴瘤患者的自然临床过程。    【关键词】  移植模型 动物 胃肿瘤 恶性淋巴瘤 肿瘤移植 裸鼠     Establishment of orthotopic transplantation model of human primary gastric malignant lymphoma in nude mice    TUO Shuai, LIU Qiuzhen, ZHANG Ning, ZHU Xiwei, WANG Mingyao. Department of Hepatobiliary Surgery, 202nd Hospital of PLA, Shenyang 110003, China    【Abstract】  Objective  To establish ideal animal models for exploring pathogenesis and experimental therapy of primary gastric malignant lymphoma.Methods  Histologically fresh primary and liver metastatic lymphoma tissues removed from patients with primary gastric malignant lymphoma were transplanted into gastric submucosa of nude mice to observe tumorgenecity, invasion and metastasis for analysis of morphological characteristics, karyotype and flow cytometry. Results  Successful transplantation of human primary gastric malignant lymphoma was seen in 9 out of 13 cases. According to the new classification standards of WHO on malignant lymphoma, there screened three strains of models, ie, orthotopic transplantation model (HGBL9903) of human primary gastric malignant lymphoma (nonHodgkin's B cell) in nude mice, metastasis model (HGBL9904) of human primary gastric malignant lymphoma (nonHodgkin's B cell) in nude mice and orthotopic transplantation model (HGBL9902) of human primary gastric malignant lymphoma (Hodgkin's B cell) in nude mice. Immunohistochemistry showed positive CD19, CD20, CD22, CD45 and CD79a, with the number of chromosome for 7587. Flow cytometry showed that DNA index (DI) ranged from 1.23 to 1.47, ie, heteroploid. Three models were passaged for 83, 87 and 89 generations respectively, where 785 nude mice were used for transplantation. Both the growth rate and resuscitation rate of liquid nitrogen cryopreservation of the transplanted tumors were 100% from the third generation. In HGBL9903, liver metastasis rate, spleen metastasis rate and lymph node metastasis rate were 100%, 36.7% and 57.6%, respectively. The transplanted tumors spontaneously grew in the stomach of nude mice to infiltrate and disrupt every layer of the gastric wall, with hematogenous metastasis (eg, liver and spleen involved), lymph node metastasis and celiac planting metastasis occurred. Conclusions  Three successfully established orthotopic transplantation models (HGBL9904, HGBL9903 and HGBL9902) of human primary gastric malignant lymphoma in nude mice are consistent with the original human gastric malignant lymphoma in aspects of histopathological and ultrastructural features, DNA content and chromosomal karyotype and hence completely simulate the natural clinical process of human primary gastric malignant lymphoma.    【Key words】  Transplantation model, animal; Gastric lymphoma;  Malignant lymphoma;  Tumor transplantation;  Nude mice    为深入探讨胃恶性淋巴瘤的生物学行为，我们将人胃恶性淋巴瘤新鲜组织块移植于裸鼠胃黏膜下层，成功地建立了1株人原发性胃非霍奇金B细胞恶性淋巴瘤裸鼠原位移植肝转移模型HGBL9903；1株人原发性胃非霍奇金B细胞恶性淋巴瘤裸鼠原位移植模型HGBL9904；1株人原发性胃霍奇金B细胞恶性淋巴瘤裸鼠原位移植模型HGBL9902。现报道如下。1  材料与方法    1.1  实验动物    BALB/Cnu/nu裸小鼠由中国医学科学院肿瘤研究所动物室提供。鼠龄3～5周，体重17～20 g，雌雄兼用，在无特殊病原体(specific pathogen free,SPF)的条件下饲养。    1.2  标本来源    人胃恶性淋巴瘤新鲜标本取自我院和辽宁省肿瘤医院，共13例。其中非霍奇金B细胞弥漫性小裂细胞型4例，非霍奇金B细胞弥漫性大细胞型5例，非霍奇金淋巴细胞型扭曲细胞2例，霍奇金大B细胞型2例。    1.3  标本处理    无菌切取的人胃恶性淋巴瘤原发灶、肝转移灶活体瘤组织小块1 cm3，置入RPMI1640培养液中，4 ℃保存转运到无菌室，清除非瘤组织，将其剪切成1 mm×1 mm×1 mm瘤组织小块，供移植用。    1.4  原位移植    裸鼠在戊巴比妥钠(30 mg/kg)静脉注射麻醉下，取上腹正中切口在胃窦部沿小弯侧切开胃壁3 mm，切口深达黏膜下层，用100无损伤缝合线将2块1 mm×1 mm×1 mm瘤组织块固定于胃壁黏膜下层，70丝线缝合腹膜，50丝线缝皮，术后继续饲养，自由进食，每周观察2次。    1.5  传代    当荷瘤裸鼠处于濒死状时，用颈椎脱位术处死，取出移植瘤。一部分瘤组织以原代移植方法行鼠间连续原位传代(每代3～5只不等)；余下瘤组织液氮冻存备用。自然死亡的荷瘤裸鼠，均解剖观察其发生肿瘤的侵袭和转移。    1.6  观察项目    1.6.1  解剖学和组织学检查    全部荷瘤裸鼠均经详细解剖学检查，测量肿瘤体积，观察侵袭周围脏器情况；观察颈部、幽门、贲门和肝门淋巴结，以及各脏器有无肿瘤转移。肿瘤组织，区域淋巴结和各脏器组织均经10 ml/L甲醛固定，石蜡切片，苏木精伊红染色，整个胃和肝脏切开全部包埋于石蜡后，于不同平面切片10～20张，光镜观察胃和肝脏转移情况。    1.6.2  免疫组织化学染色    采用LSAB法，对全部胃肿瘤或有器官转移的切片应用CD19、CD20、CD22、CD45、CD79a抗体染色，所用试剂均购自Dako公司。    1.6.3  电镜观察    移植瘤组织以2.5%戊二醛和1%锇酸双重固定，Epon812包埋，超薄切片，铀铅染色后PHILIPSCM10透射电镜观察。    1.6.4  流式细胞分析［1］    采用美国FACS420型流式细胞仪对正常胃黏膜细胞、移植瘤细胞进行DNA含量测定。    1.6.5  染色体检查    采用短期培养，不加有丝分裂刺激方法，常规制片，GTGI法染色，显微镜下观察［2］。    1.6.6  胃恶性淋巴瘤分类标准    采用2001年WHO新分类方法［3］。    1.7  统计学处理    采用SPSS10.0统计软件处理，t检验，数据以±s表示，P<0.01为差异有统计学意义。2  结果    2.1  人胃恶性淋巴瘤裸鼠原位移植结果    13例人胃恶性淋巴瘤标本原位移植裸鼠后 ，9例(非霍奇金B细胞弥漫性小裂细胞型2例，非霍奇金B细胞弥漫性大细胞型3例，非霍奇金淋巴细胞型扭曲细胞2例，霍奇金大B细胞型2例)移植成功，首代移植成功率为69.26%。依据淋巴瘤新WHO分类标准，从中筛选出1株人胃非霍奇金B细胞弥漫性小裂细胞型恶性淋巴瘤裸鼠原位移植肝转移模型，命名为HGBL9903；1株人胃非霍奇金B细胞弥漫性大裂细胞型恶性淋巴瘤裸鼠原位移植模型， 命名为HGBL9904； 1株人胃原发性霍奇金大B细胞型恶性淋巴瘤裸鼠原位移植模型， 命名为HGBL9902， 其余做传代实验。    2.1.1  人原发性胃恶性淋巴瘤裸鼠原位移植模型的建立。    2.1.1.1  HGBL9903模型的建立：瘤源标本来自1例42岁女性患者，病理诊断：胃原发性恶性非霍奇金弥漫性小裂细胞型淋巴瘤伴肝转移。取其原发灶和肝转移灶瘤组织块分别移植裸鼠各5只，原发灶组织首代移植5只裸鼠中4只获得移植成功，首代移植成功率为80%；肝转移灶组织首代移植5只裸鼠均获得移植成功。目前已传至83代，共移植裸鼠253只，平均潜伏期为8.4 d，传代间期为27 d。从第3代起肿瘤的移植生长率和液氮冻存复苏成活率均为100%。尸解发现：胃窦部和部分胃体胃壁显著增厚变硬，与人胃硬癌相似。切面观察见：胃小弯增厚明显，灰白色，有光泽，肌层大部分被破坏，有的胃壁各层均被瘤细胞侵袭破坏，胃黏膜皱襞显著变粗。经病理切片检查253只裸鼠胃内均有肿瘤生长，有的肿瘤广泛浸润裸鼠全胃，穿透浆膜层后播及邻近区域淋巴结；127只见小弯侧冠状静脉旁淋巴结及幽门下淋巴结有转移。移植裸鼠的肝转移和腹腔种植转移率为100%(253/253)，93只有脾转移，占36.7%(93/253)。    2.1.1.2  HGBL9904模型的建立：瘤源标本取自1例69岁男性患者，病理诊断：胃原发性恶性非霍奇金弥漫性大裂细胞型淋巴瘤。取其原发灶组织首代移植的5只裸鼠均获首代移植成功。目前已传至87代，共移植裸鼠263只，平均潜伏期7.6 d，传代间期28 d，移植瘤的传代成功率和液氮冻存复苏成活率均为100%。尸解发现：胃小弯有不规则形多发性溃疡，其边缘胃黏膜皱襞变粗。切面：溃疡边缘处肿瘤主要在黏膜下层，底部胃肌层全部被破坏，瘤组织呈灰白色，均匀而有光泽。经病理切片检查263只裸鼠胃窦、胃小弯、幽门区均有肿瘤生长，荷瘤裸鼠的最长生存期为76.5 d，一般于第6～7周因衰竭而濒临死亡。    2.1.1.3  HGBL9902模型的建立：瘤源标本来自1例32岁男性患者，病理诊断：胃原发性霍奇金弥漫性大B细胞型淋巴瘤。取其原发灶瘤组织首代移植5只裸鼠均获得首代移植成功。目前已传至89代，共移植裸鼠269只，平均潜伏期为13.4 d，传代间期为35 d，肿瘤移植生长率和液氮冻存复苏成活率均为100%。尸解发现：胃幽门区增厚，肠系膜淋巴结肿大，胃黏膜面可见十余个大小不等半球形或不规则形结节病灶，直径约为0.2～0.3 cm，黏膜皱襞变粗隆起。切面观察见结节主要位于黏膜层，灰白色，边界不清。经病理切片检查269只裸鼠胃内均有肿瘤生长。    2.1.2  人原发性胃恶性淋巴瘤裸鼠原位移植模型的侵袭和转移。    2.1.2.1  淋巴结转移：以胃小弯侧冠状静脉旁淋巴结及幽门下淋巴结转移最多见。淋巴结转移可分为：①早期：淋巴结的结构仍然保存，淋巴窦扩张，窦内出现散在的或小灶型瘤细胞；②中期：瘤细胞向副皮质区和髓质内侵袭性生长；③晚期：淋巴结原有的结构完全消失，除少量淋巴组织残余外，几乎完全由大片成堆的瘤细胞替代。    2.1.2.2  肝转移： 出现在原位移植第4周末，HGBL9903肝转移多局限在肝左叶，为单结节型，少数动物肝左右叶均可见到多发性转移瘤结节，转移灶小至血管内癌栓，大至肉眼可见最大直径为1.0～1.5 cm。病理组织学检查表明HGBL9903肝转移瘤为胃非霍奇金弥漫性小裂细胞型恶性淋巴瘤(图1)，瘤细胞以中央静脉，汇管区为转移中心，经肝血窦逐渐浸润到整个肝组织。    图1  HGBL9903肝组织切片示胃原发性非霍奇金B细胞恶性淋巴瘤肝内转移  (HE  ×200)    2.1.2.3  脾转移：出现在原位转移第5周末，脾肿大，充血，转移瘤位于脾的上极或中心部位，脾窦被挤压而残缺不全，小梁和被膜常被累及。    2.1.2.4  腹膜种植性转移：出现在原位移植第5周，HGBL9903模型腹膜全部密布多数或无数个灰白色、小的瘤结节，或呈弥漫性增厚，并可伴发血性腹水。    2.2  组织病理学与电镜检查结果    HGBL9903光镜下以B小裂细胞为主，外型不规则，伴有核切迹或深浅不等，核裂、核染色质较粗，可见核仁，胞质稀少，胃黏膜腺体被浸润分隔，萎缩、胃壁各层被瘤细胞所浸润(图2)。电镜下瘤细胞核有切迹和裂沟，异染色质丰富，成块状沿核膜分布，核仁中小型靠近核膜，胞质少，可见少量线粒体，短小扩张的粗面内质网。    图2  HGBL9903胃瘤组织切片示胃原发性非霍奇金B细胞恶性淋巴瘤弥漫地浸润胃壁全层  (HE  ×200)    HGBL9904光镜下以B大细胞型为主，核大多形性，常见核裂，核染色质不均匀，偶见核仁、胞质少、细胞间有较多间质、弥漫排列，胃壁各层被瘤细胞浸润(图3)。电镜下瘤细胞核形态不规则，核有较深裂沟。异染色质沿核膜分布呈条块状，核仁大小不一，靠近核膜，胞质少，可见少数肿胀空泡变的线粒体改变。    图3  HGBL9904胃瘤组织切片示胃原发性非霍奇金B细胞恶性淋巴瘤弥漫地浸润胃壁全层  (HE  ×200)    HGBL9902光镜下以大B无裂细胞为主，核大，圆形或卵圆形，染色质稀少，核仁清晰，可见1～2个，多数附着核膜，胞质量少，核分裂像多见，多倍型RS细胞散在分布(图4)。电镜下瘤细胞体积大，椭圆型，核为双叶，对称，核内常染色质明显，核仁可见，胞质较少，有中等量核蛋白体，短小粗面内质网及线粒体。细胞表面有微小突起。RS细胞附近可见淋巴细胞。    图4  HGBL9902胃瘤组织切片示胃原发性非霍奇金B细胞恶性淋巴瘤弥漫地浸润胃壁全层  (HE  ×400)    2.3  免疫组化检查结果    HGBL9904、HGBL9903和HGBL9902移植瘤细胞，肝、淋巴结转移瘤细胞对CD19、CD20、CD22、CD45、CD79a呈阳性表达。    2.4  移植瘤细胞DNA含量分析    HGBL9903、HGBL9904和HGBL9902移植瘤的DNA检测均示异倍体，结果见表1。表1  3株人胃原发性恶性淋巴瘤裸鼠原位移植瘤    2.5  染色体核型分析    裸鼠移植瘤为人类肿瘤细胞核型，染色体数目从75～89条，表现为超三倍体或亚四倍体。3  讨论    有关胃恶性淋巴瘤的病因学和发病机制迄今尚不清楚，临床症状、体征缺乏特异性，易与胃癌混淆，术前诊断十分困难［4-5］。与其他肿瘤相比，基础和临床研究的深度和广度均有限，原因是对本病的生物学特性认识有限，缺少可供直接研究的肿瘤组织标本和供实验研究的肿瘤动物模型。    本实验采用组织学完整的人胃恶性淋巴瘤新鲜组织原位移植于裸鼠，成功地建立了HGBL9903、HGBL9904和HGBL9902三株人胃恶性淋巴瘤裸鼠原位移植模型。经笔者检索，属国内外首次。我们所建立的3株人胃原发性恶性淋巴瘤裸鼠原位移植模型，经过6年多的长期连续系统传代，已形成了科系多，传代长，生物学特性与人胃原发性恶性淋巴瘤相似的模型系统。不仅移植瘤的组织学、免疫组化表型、超微结构、DNA倍体水平和染色体特点与来源肿瘤完全一致，而且肿瘤移植成活率、液氮冻存复苏成活率均为100%，说明该模型系统的生物学特性是稳定的。本研究发现，人胃恶性淋巴瘤裸鼠原位移植瘤的好发部位和不同病变发生率与人胃恶性淋巴瘤很相似。人胃恶性淋巴瘤在裸鼠胃壁内呈自主的、局限性或弥漫性全胃浸润生长，但以胃窦、小弯、幽门区多见。有的荷瘤裸鼠肿瘤广泛浸润时，胃壁增厚变硬，表面黏膜皱襞粗大似胃硬癌，可见胃局部淋巴结转移，甚至转移于肝、脾和腹膜种植转移。Cowan等［6］报道恶性淋巴瘤的肝侵犯与细胞类型有关，小裂细胞淋巴瘤可高达40%～60%。本实验肝转移移植模型即为1株恶性淋巴瘤小裂细胞分型。而本文HGBL9903模型荷瘤裸鼠肝侵犯率为100%，高于文献报道；脾侵犯率为36.7%，与文献报道相似。累及肝的荷瘤裸鼠几乎同时有脾累及，脾累及荷瘤裸鼠同时有肝累及。由于瘤细胞常穿透胃浆膜层，可见腹膜种植转移。本实验HGBL9903模型腹膜种植转移率为47.6%与陈峻青等［7］报道的进展期胃癌腹膜种植转移40%～50%相似，提示胃恶性淋巴瘤与胃癌可能具有相似的腹膜种植发生率和转移模式。由此可见，本研究所建立的3株人胃恶性淋巴瘤裸鼠原位移植模型完整地重现了人胃恶性淋巴瘤患者的临床病理过程，可用于胃淋巴瘤发病机制，病因学预防和实验治疗研究。    胃恶性淋巴瘤组织原位移植于裸鼠胃内出现广泛播散的原因有：①肿瘤细胞本身高恶性潜能。本研究表明，移植成功的3株胃恶性淋巴瘤裸鼠原位移植模型的组织标本均取材于进展期的胃淋巴瘤标本，证明临床进展期患者标本是建立人癌转移模型的基础。②与移植部位微环境因素有关，如胃的特殊结构、丰富的淋巴、血液循环、生化和免疫学特点等。正是由于裸鼠胃的微环境与人胃的相似性，使植入的肿瘤出现类似于人胃恶性淋巴瘤患者体内的扩散过程。    综上所述，我们所建立的HGBL9904、HGBL9903和HGBL9902三株裸鼠原位移植模型，在形态学、生物化学、免疫学及遗传学方面保持了人胃恶性淋巴瘤的生物学特性，为胃恶性淋巴瘤的基础与临床研究提供了理想的动物模型平台。【参考文献】［1］ Krugmann J, Gschwendtner A, Mairinger T, et al. 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