DNA倍体分析联合腹水/血清CEA比值测定对腹水性质鉴别诊断价值

作者：王青    作者单位：青岛市市立医院消化科，山东 青岛 266011

【摘要】  目的 探讨应用流式细胞仪(FCM)进行腹水细胞DNA倍体分析，以及联合检测腹水/血清癌胚抗原（CEA）比值对良、恶性腹水的鉴别诊断价值。方法 应用流式细胞术对106例腹水病人（良性腹水50例，恶性腹水56例）进行腹水细胞DNA倍体分析，以腹水细胞中发现异倍体为阳性；同时采用ELISA法进行腹水及血清CEA测定，以血清或腹水CEA浓度>5 μg/L、腹水/血清CEA比值>1为阳性。结果 恶性腹水组病人的腹水/血清CEA比值阳性率及腹水中检出异倍体的阳性率均明显高于良性腹水组。腹水/血清CEA比值阳性和腹水中检出异倍体诊断恶性腹水的灵敏度和特异度分别为51.79%、98.00%和71.43%、86.00%。腹水中检出异倍体与腹水/血清CEA比值阳性联合诊断恶性腹水的灵敏度和特异度分别为92.86%和100%。结论 DNA倍体分析、腹水/血清CEA比值检测对于鉴别良、恶性腹水是有价值的生物学指标，二者联合可以提高鉴别诊断良、恶性腹水的灵敏度和特异度，提高诊断效能。

【关键词】  腹水 癌胚抗原 DNA倍体分析 诊断 鉴别

　　THE DIFFERENTIAL DIAGNOSTIC SIGNIFICANCE OF COMBINED DNA PLOIDY ANALYSIS AND ASCITES/SERUM CARCINOEMBRYONIC ANTIGEN RATIOS ASSAY IN MALIGNANT ASCITES

　　WANG QING, ZHANG AIJUN, XU LIN, et al

　　Department of Gastroenterology,  Qingdao Municipal Hospital, Qingdao  266011, China

　　［ABSTRACT］ Objective To investigate the differential diagnostic significance of DNA ploidy analysis and ascites/serum carcinoembryonic antigen ratio assay in malignant and benign ascites. Methods Flow cytometry (FCM) was used for DNA ploidy analysis. If a aneuploidy was detected, the result of the DNA ploidy analysis was defined as positive. Enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) was used to detect CEA in both ascites and serum. CEA value >5 μg/L and ascites/serum CEA ratio>1 was considered positive. Results The positive rates of serum CEA, ascitic CEA, ascites/serum CEA ratio and aneuploidy in malignancy were higher than those in benign ascites group. The sensitivity and  specificity of  ascites/serum CEA ratio  in diagnosis of malignant ascites were 51.79%,98.00% and that of aneuploidy were 71.43%,84.00%. The sensitivity and specificity of combined usage of aneuploidy and ascites/serum CEA were 92.86% and 100%. Conclusion Our study confirmed the value of ascites/serum CEA ratios assay and DNA ploidy analysis in differential diagnosis of malignant ascites, and the combination of ascites/serum CEA ratios assay and the DNA ploidy analysis could increase sensitivity and specificity of differential diagnosis of malignant ascites from benign ascites.

    ［KEY WORDS］ Ascites; Carcinoembryonic antigen; DNA ploidy analysis; Diagnosis, differential

    腹水的病因诊断是一个临床难题，恶性肿瘤引起的恶性腹水约占腹水病因的10%，预后极差，临床上以腹水为主要表现的病人，应该首先鉴别其良、恶性质。本文以流式细胞仪检测腹水细胞的DNA倍体，并联合基于酶联免疫吸附法（ELISA）检测的腹水和血清癌胚抗原（CEA）浓度计算出的腹水/血清CEA比值作为指标，探讨其在良、恶性腹水鉴别诊断中的临床意义。

　　1  对象和方法

　1.1  研究对象

    选取2005年1月～2007年3月期间在我院消化科住院的腹水病人共106例，其中男65例，女41例，平均年龄（57.2±10.1）岁。经腹水常规、生化、细胞学检查、腹腔镜检查或剖腹手术等方法确诊为恶性腹水56例：原发性肝癌31例，胃癌6例，结直肠癌6例，胆管癌3例，胰腺癌3例，卵巢癌2例，乳癌1例，恶性腹膜间皮瘤1例，非霍奇金淋巴瘤1例，原发灶来源不明的腹膜转移癌2例，其中经腹水行细胞学检查确诊25例，占44.6%。良性腹水50例：肝硬化腹水34例，结核性腹膜炎6例，慢性心力衰竭4例，胰腺炎2例，细菌性腹膜炎1例，肾病综合征1例，慢性肾衰竭1例，系统性红斑狼疮1例。两组病人在性别和年龄构成上差异均无显著性。另选取10例健康体检者的静脉全血作为流式细胞仪检测DNA倍体时的二倍体对照。

　　1.2  主要实验试剂与仪器

    CEA酶联免疫反应试剂盒由瑞典CanAg公司提供；细胞DNAPrep检测试剂盒由美国BECKMAN COULTER公司提供。全自动酶标分析仪（伯乐680型，美国），流式细胞仪（EPICS XLMCL型，美国），低温高速离心机（Contifuge Stratos型，德国）。

　　1.3  标本制备

    按腹膜腔常规穿刺方法进行腹腔穿刺，抽取腹水100 mL行 DNA倍体分析及ELISA法检测腹水CEA浓度；同时常规静脉穿刺取血2 mL, 离心分离血清，ELISA法检测血清CEA浓度。

　　1.4  腹水DNA倍体分析

    由我院中心实验室按试剂盒说明书对腹水脱落细胞进行DNA倍体分析，以正常人新鲜淋巴细胞的DNA荧光信号主峰值作为二倍体细胞DNA含量的参考值，以腹水中二倍体细胞DNA含量作为内标，由仪器自带程序对样品细胞的DNA指数、增殖指数、S期细胞百分率等指标进行分析，并绘出直方图。若直方图上出现与二倍体细胞G0/1峰完全分离的荧光信号峰（DI≠1），即判断受检标本含有DNA异倍体细胞，为阳性。

　　1.5  血清及腹水CEA浓度测定

    按试剂盒说明书操作，将25 μL血清或腹水标本、标准液、控制液及100 μL抗体加入反应微孔中，室温下反应1 h；用稀释的洗液反复冲洗6次，再加入100 μL染色剂，37 ℃孵化30 min；然后加入100 μL反应终止液，在15 min内于405 nm波长处读出吸光度（A）值，以吸光度值为纵坐标，以标准品浓度为横坐标，绘制标准曲线。根据血清或腹水样品的吸光度值可在标准曲线上查出其浓度，结果由全自动酶标分析仪自动产生。按照试剂盒说明书，血清和腹水的CEA阳性界值为 5 μg/L。若血清或腹水CEA阳性，则计算腹水/血清CEA比值，以比值>1为阳性。

　　1.6  统计学处理

    计量资料以±s表示，组间比较采用t检验；计数资料以率或构成比表示，应用χ2检验。

　　2  结 果

　　2.1  腹水细胞DNA倍体分析

    本文56例恶性腹水病人中有40例（71.43%）检出异倍体，明显高于良性腹水病人异倍体检出率（16.00%），差异有显著性（χ2=32.75，P<0.01）。异倍体区别良性、恶性腹水的灵敏度为71.43%（40/56），特异度为84.00%(42/50)。见表1。

　　2.2  腹水/血清CEA比值检测

    恶性腹水病人腹水/血清CEA比值阳性率为51.79%（29/56），明显高于良性腹水病人的阳性率（2.00%），差异有显著性（χ2=32.27，P<0.01）。腹水/血清CEA比值区别良、恶性腹水的灵敏度为51.8%（29/56），特异度为98.0%(49/50)。见表1。表1  良、恶性腹水细胞DNA倍体分析与腹水/血清CEA比值检测结果的关系（略）

　　2.3  腹水细胞DNA倍体分析联合腹水/血清CEA比值检测

    恶性腹水组DNA倍体分析与腹水/血清CEA比值同时阳性占30.36%(17/56),良性腹水组则为0,DNA倍体分析联合腹水/血清CEA比值检测可使恶性腹水的诊断率由DNA倍体分析的71.43%、腹水/血清CEA比值的51.79%升高到92.86%(52/56)。DNA倍体分析联合腹水/血清CEA比值检测鉴别腹水良、恶性病变的灵敏度为92.86%(52/56)，特异度为100%(50/50)。

　3  讨 论

    临床上引起腹水的常见病因有肝硬化、充血性心力衰竭、肾病、结核杆菌感染、胰腺炎、其他病原微生物感染、恶性肿瘤、结缔组织病等，其中由恶性肿瘤引起者称为恶性腹水，通常是恶性肿瘤腹腔内侵犯的第一个体征。GARRISON等[1]报道，52%的恶性肿瘤病人在原发癌诊断时已有明显腹水。腹腔穿刺抽取腹水进行常规、生化、细胞学等方面的检查，可较准确地鉴别腹水的性质，尤其是腹水细胞病理学检查，阳性者有确诊意义，至今仍被作为“金标准”。但其阳性率仅有50%左右，限制了其在临床上的应用[2]。腹腔镜检查对于不明原因腹水的病因诊断有很高的准确性[3]，但也有在恶性腹水病人中导致肿瘤沿腹壁创孔播散的担忧[4]。近年来随着对恶性腹水病因研究的不断进展，恶性腹水的治疗发生了令人鼓舞的变化，在经过选择的小规模人群的治疗试验已经取得了很大进展，但是这些方法大多存在一定的危险性，不适合作为各种腹水治疗的共同选择，这就迫切要求人们寻找一种有效的方法，来准确鉴别良性腹水和恶性腹水。

    CEA是一种结构复杂的可溶性糖蛋白，具有二级以上结构。胚胎期主要存在于胎儿的胃肠管、胰腺和肝脏，出生后逐渐消失或仅存留微量。当细胞癌变时，CEA可重新合成，并表达于肿瘤细胞表面，也可分泌到血流中，具有促进转移的作用，可能与干扰原发灶内肿瘤细胞间连接有关。血清CEA升高最常见于消化道肿瘤，但在乳癌、肺癌、胰腺癌、泌尿系肿瘤等多种肿瘤中也有表达，其在良、恶性腹水的鉴别诊断中有一定价值，但特异性不高[5]。一些非肿瘤疾病如肝衰竭、大量吸烟者、慢性溃疡性结肠炎、Crohn 病等亦有血CEA低水平升高，设想提高界值可望提高特异度，但灵敏度也会随之降低。

    CEA也可被分泌入浆膜腔内，由于其分子质量大，分泌后能够潴留在浆膜腔内而不会像在血浆中那样被迅速降解，检测其浓度有助于鉴别良、恶性浆膜腔积液[6]。但因为血中CEA可漏出和渗出到胸腹水中，使胸腹水中的CEA值升高，所以单纯以胸腹水中CEA值作为诊断依据假阳性多，特异度差。

    TRAPE 等[7]评估了联合测定浆膜腔积液和血清中的5种肿瘤标志物在鉴别诊断胸腹膜腔积液性质中的作用。结果表明，恶性浆膜腔积液中肿瘤标志物浓度明显高于良性积液或血清中浓度。CEA、CA199和CA153积液/血清比值分析较单一积液检测结果显示了更好的灵敏度和最大的特异度，认为CEA检测其积液/血清比值能够提高诊断的灵敏度和特异度。本研究检测腹水/血清CEA比值鉴别良性、恶性腹水的灵敏度为51.8%（29/56），特异度为98.00%(49/50)，与国内有关文献报道类似[8]，表明腹水/血清CEA比值在良、恶性腹水的鉴别诊断中有一定价值。

    正常人体细胞多为二倍体，非整倍体和多倍体很少见，而恶性肿瘤细胞具有不可抑制的克隆性增殖，且分裂呈多极、紊乱。恶性腹水中有一定数量的癌细胞分裂象，并有明显的染色异常改变。周秀彦等[9]应用高分辨染色技术，发现恶性腹水病人中，其染色体出现多倍体、超二倍体、亚四倍体及染色体出现缺失、畸变者达82.35%，提示腹水染色体检查对良、恶性腹水的鉴别具有重要意义。本研究中DNA异倍体在恶性腹水组病人中的阳性率为71.43%，明显高于良性腹水组的阳性率。以腹水中找到异倍体细胞为标准鉴别诊断良、恶性腹水的灵敏度为71.43%，特异度为86.00%，与有关文献报道结果接近[10～12]，提示检测腹水中的异倍体对于鉴别诊断良、恶性腹水有一定价值，但仍存在一定的假阳性率和假阴性率。假阳性的产生可能与标本制作过程中的某些染色体发生机械性缺失有关，标本中存在较多炎性细胞和多核细胞也可导致检出非整倍体可能，少数良性疾病细胞内的染色体可产生一过性畸变也是造成假阳性的原因之一[13]；造成假阴性的主要原因分析与肿瘤细胞未脱落至浆膜腔以及存在高分化的二倍体肿瘤等因素有关。

  综上所述，各个单项检查在恶性腹水的鉴别诊断中均有一定价值，但均存在一定的局限性。为了提高灵敏度和特异度，我们以腹水细胞检出异倍体联合腹水/血清CEA比值阳性为标准鉴别诊断良、恶性腹水的灵敏度为92.86%，特异度100%，联合检测较各单项指标灵敏度与特异度均有明显提高，说明二者具有较好的互补性，可以克服单项检测固有的一些缺陷，对于良、恶性腹水鉴别诊断有很高的应用价值。

【参考文献】  　　[1]GARRISON R N, KAELIN L D, GALLOWAY R H, et al. Malignant ascites. Clinical and experimental observations[J]. Ann Surg, 1986,203(6):644651.

　　[2]PARSONS S L, WATSON S A, STEELE R J. Malignant ascites[J]. Br J Surg, 1996,83(1):614.

　　[3]张炳远,张斌,闫尚伦. 腹腔镜技术对不明原因腹水的诊断价值[J]. 青岛大学医学院学报, 2003,39(3):231232.

　　[4]MUENSTERER O J, AVERBACH A M, JACQUET P, et al. Malignant peritoneal mesothelioma. Casereport demonstrating pitfalls of diagnostic laparoscopy[J]. Int Surg, 1997,82(3):240243.

　　[5]SARI R, YILDIRIM B, SEVINC A, et al. The importance of serum and ascites fluid alphafetoprotein, carcinoembryonic antigen, CA199, and CA153 levels in differential diagnosis of ascites etiology[J]. Hepatogastroenterology, 2001,48(42):16161621.

　　[6]NYSTROM J S, DYCE B, WADA J, et al. Carcinoembryonic antigen titers on effusion fluid. A diagnostic tool[J]? Arch Intern Med, 1977,137(7):875879.

　　[7]TRAPE J, MOLINA R, SANT F. Clinical evaluation of the simultaneous determination of tumor markers in fluid and serum and their ratio in the differential diagnosis of serous effusions[J]. Tumour Biol, 2004,25(56):276281.

　　[8]曾志勇,钟英强,黄志清. 腹水与血清的癌胚抗原比值对恶性腹水的诊断价值[J]. 临床消化病杂志, 2003,15(1):78.

　　[9]周秀彦,郭春华,赵婕,等. 染色体检查对良、恶性腹水的鉴别诊断价值[J]. 山西临床医药杂志, 2000,9(5):323.

　　[10]SAHA I, DEY P, VHORA H, et al. Role of DNA flow cytometry and image cytometry on effusion fluid[J]. Diagn Cytopathol, 2000,22(2):8185.

　　[11]LAZCANO O, CHEN L M, TSAI C, et al. Image analysis and flow cytometric DNA studies of benign and malignant body cavity fluids: reappraisal of the role of current methods in the differential diagnosis of reactive versus malignant conditions[J]. Mod Pathol, 2000,13(7):788796.

　　[12]殷缨,张盈华,郝晓柯,等. 流式细胞术在胸腔积液及腹水细胞诊断中的价值[J]. 肿瘤防治杂志, 2002,9(1):5961.

　　[13]王强,吴清明,于皆平. 食管黏膜脱落细胞DNA倍体和端粒酶活性检测对食管癌诊断的价值[J]. 肿瘤防治杂志, 2004,11(10):1054.