重组人肝再生增强因子对梗阻性黄疸大鼠肝细胞线粒体功能的保护作用

重组人肝再生增强因子对梗阻性黄疸大鼠肝细胞线粒体功能的保护作用作者：唐春 别平 李昆 张玉君 马正伟　　作者单位：400038 重庆，第三军医大学西南医院全军肝胆外科研究所、中国人民解放军西南肝胆医院    【摘要】  目的 探讨重组人肝再生增强因子(rhALR)对梗阻性黄疸大鼠肝细胞线粒体功能及肝功能的保护作用。方法 144只健康Wistar大鼠随机分为SHAM组、BDORBF组、BDORBFrhALR组，分别检测其线粒体功能及肝功能的变化情况，电镜观察各组大鼠肝细胞线粒体的形态学改变。结果 胆道梗阻后，大鼠线粒体功能及肝功能均出现明显损伤(P＜0.05或P＜0.01)，BDORBFrhALR组肝细胞线粒体功能及肝功能的损害程度明显轻于BDORBF组(P＜0.05)，并且当胆管再通后，其恢复更快。电镜观察梗阻性黄疸后，肝细胞线粒体出现明显损伤，BDORBFrhALR组病理改变明显轻于BDORBF组。结论 rhALR对梗阻性黄疸大鼠肝细胞线粒体功能及肝功能具有明显的保护作用。     【关键词】  重组人肝再生增强因子 线粒体功能 梗阻性黄疸 大鼠     Beneficial effects of recombinant human augmenter of liver regeneration on mitochondrial function in rats with obstructive jaundice  TANG Chun, BIE Ping, LI Kun, ZHANG Yujun, MA Zhengwei. Southwest Hospital & Institute of Hepatobiliary Surgery, Third Military Medical University, Chongqing 400038, China    【Abstract】  Objective  To study the beneficial effects of recombinant human augmenter of liver regeneration (rhALR) on mitochondrial function and liver function in rats with obstructive jaundice. Methods  A total of 144 healthy Wistar rats were randomly divided into three groups, ie, sham operation group (Group A), obstructive jaundice and biliary tract recanalization (Group B) and obstructive jaundice and biliary tract recanalization plus rhALR (Group C) to respectively observe, at selected time points, the changes of the liver and mitochondrial function as well as morphologic changes of the mitochondriae by electroscope. Results  There occurred more severe damage to liver function and mitochondrial function in Group B, compared with Group A (P＜0.05 or P＜0.01). Compared with Group B, the degree of damage to mitochondrial and liver function was lighter in Group C (P<0.05). The electron microscope showed that mitochondrial structure was damaged in obstructive jaundice rats. The pathological change in Group C was significantly less than that in Group B. Conclusion  rhALR can exert obvious protective effect on mitochondrial function and liver function of rats with obstructive jaundice.    【Key words】  Recombinant human augmenter of liver regeneration; Mitochondrial function; Obstructive jaundice; Rats    线粒体是梗阻性黄疸时肝细胞内最先受损害的细胞器［1］。线粒体功能是决定肝细胞功能的重要因素［2］。本实验通过给予梗阻性黄疸大鼠以重组人肝再生增强因子 (recombinant human augmenter ofliver regeneration，rhALR)，旨在了解rhALR能否通过保护及改善肝细胞线粒体功能、肝功能，为梗阻性黄疸的围手术期处理提供帮助。1  材料与方法    1.1  实验动物模型制作及分组    健康Wistar大鼠144只，体重175～330 g，平均(214.94±32.33)g，由第三军医大学及大坪医院实验动物中心提供，雌雄不限，随机分为3组：    假手术(SHAM)组：开腹后，暴露肝门，游离胆总管后关腹，部分动物于14 d后再次开腹，分离腹腔粘连，暴露肝门后关腹。    梗阻性黄疸及胆管再通(BDORBF)组：胆总管中上1/3行胆总管双重结扎并切断制成梗阻性黄疸模型；部分动物14 d后于近端扩张胆总管与十二指肠第二肠段间架桥插入一直径约2 mm的硅胶管并固定行胆管再通［3］。    梗阻性黄疸及胆管再通给予rhALR(BDORBFrhALR)组：手术方法同BDORBF组，同时于胆总管结扎术后腹腔注射rhALR 40 μg/kg，每12小时1次，至动物处死。rhALR由空军广州医院全军传染病中心孔祥平教授惠赠。同时，SHAM组和BDORBF组腹腔内注射等量生理盐水作为对照。    各组观察时相点为第一次术后1、4、7、14、15、18、21、28 d，每时相点6只。    1.2  观测指标及方法    1.2.1  线粒体形态学观察    将到时相点动物处死后取肝组织块浸于3%戊二醛中，固定后送第三军医大学电镜室行透射电镜观察。    1.2.2  肝功能检测    采取各时相点动物静脉血，常规检测ALT、AST、TBIL及ALB。    1.2.3  线粒体功能检测    本实验采用线粒体呼吸控制率(respiratory control ratio，RCR)、磷氧比以及肝组织ATP含量作为线粒体功能指标。分别以Estabrook氧电极法测定线粒体RCR和磷氧比值以及Kimmich方法测定肝组织内ATP含量。    1.3  统计分析    本实验采用SPSS 12.0 for Windows统计软件进行统计分析。采用t检验，统计数据以±s表示，P＜0.05为差异有统计学意义。    唐春，等. 重组人肝再生增强因子对梗阻性黄疸大鼠肝细胞线粒体功能的保护作用 2  结果    2.1  线粒体形态学改变    电镜下，SHAM组肝细胞线粒体结构完整，基质均匀，未见明显异常(见图1)。梗阻性黄疸后，肝细胞线粒体出现明显肿胀，基质密度减低甚至消失，嵴断裂、减少、消失，严重者整个线粒体高度肿胀呈大泡状改变。BDORBFrhALR组的大鼠，其病理改变明显轻于BDORBF组的大鼠(见图2、3)。    2.2  肝功能改变情况    SHAM组术后，肝功能各项指标无明显变化；BDORBF组大鼠，肝功能出现明显损害(P＜0.05)，ALT、AST及TBIL增高， ALB下降， 其损害随着梗阻时间的延长而逐步加重，当胆管再通后，肝功能随着时间延长逐步恢复。BDORBFrhALR组的大鼠，其肝功能的损害程度明显轻于BDORBF组的大鼠(P＜0.05)，并且在胆管再通后，给予rhALR治疗的大鼠相对于未给予rhALR治疗的大鼠，其肝功能恢复更快。在胆管再通后第7天，BDORBFrhALR组大鼠肝功能已接近正常，到再通后第14天，BDORBFrhALR 组大鼠肝功能已基本恢复正常(与SHAM组比较，P＞0.05)。而BDORBF组大鼠仍表现出肝功能异常(与SHAM组和BDORBFrhALR组比较，P＜0.05)(见表1)。    在本实验中，我们发现大鼠在胆道梗阻后第1天，ALT、AST明显升高，其改变幅度甚至大于梗阻后14 d，我们分析可能与麻醉、胆总管急性梗阻以及应激因素等有关。 表1  大鼠梗阻性黄疸及再通后肝功能变化情况    2.3  肝细胞线粒体功能变化情况    SHAM组术后，肝细胞线粒体功能各项指标无明显变化；BDORBF组的大鼠，线粒体功能出现明显损害(P＜0.01)，具体表现为RCR、磷氧比及肝组织ATP含量下降，其损害随着梗阻时间的延长而逐步加重；给予rhALR治疗的大鼠，其线粒体功能的损害程度明显轻于未给予rhALR治疗的大鼠(P＜0.05)，并且在胆管再通后，BDORBFrhALR组的大鼠相对于BDORBF组的大鼠，其线粒体功能恢复更快，在胆管再通后第14天，BDORBFrhALR组大鼠肝细胞线粒体功能已基本恢复正常(与SHAM组比较，P＞0.05)，而BDORBF组大鼠线粒体功能仍未完全恢复(与SHAM组及BDORBFrhALR组比较，P＜0.05)(见表2)。表2  大鼠梗阻性黄疸及再通后肝细胞线粒体 功能变化情况3  讨论    梗阻性黄疸是临床上常见的疾病，多由结石及肿瘤引起，常需手术治疗。对于一些恶性肿瘤引起的梗阻性黄疸，大部分患者就诊时间晚、胆道梗阻时间久、黄疸深、肝功能严重受损，降低了患者的手术耐受能力。因而有效地保护和改善患者手术前后的肝功能，对其围手术期处理将具有重要的意义。    梗阻性黄疸时由于正常的胆汁排泄受阻，首先引起胆汁酸在肝细胞内淤积，胆汁酸对肝细胞内的线粒体结构和功能有明显损害作用，线粒体是梗阻性黄疸时肝细胞内最先受损害的细胞器［4］。在本实验中，我们也发现，胆道梗阻后的大鼠，肝细胞的线粒体结构和功能出现了明显损害，主要表现为RCR、磷氧比及肝组织ATP含量下降，线粒体超微结构明显受损。而线粒体功能是决定肝细胞功能的重要因素［2］。本实验中，梗阻性黄疸大鼠的肝功能，随着肝细胞线粒体功能的改变，也出现了相应的损伤，主要表现为ALT、AST及TBIL增高，ALB下降，其严重程度与线粒体功能损害程度相一致。因而，若能有效地保护及改善梗阻性黄疸肝细胞线粒体功能，则可能达到保护及改善梗阻性黄疸肝功能的目的。    1994年，Hagiya等［4］从刚断乳的大鼠肝组织中发现了一种新型的促肝细胞增殖因子，称之为肝再生增强因子(augmenter of liver regeneration，ALR)。近年来的研究表明，ALR是一种特殊的无种属特异性的促肝细胞分裂因子，在肝损伤修复过程中发挥着重要作用。它可有效地促进肝部分切除后的肝再生，并且可减轻和/或避免CCl4等造成的肝损伤［5］。但在梗阻性黄疸中，ALR是否具有保护及改善肝功能的作用，经笔者检索目前仍无相关报道。本实验中，我们对梗阻性黄疸大鼠腹腔内注射rhALR，发现予以rhALR治疗的大鼠，其线粒体功能明显好于未给予组，胆管再通后，其线粒体功能也恢复得更快；从电镜超微结构上看，其线粒体的病理改变也较未给予组轻；相应地，其肝功能也明显好于未给予组。说明rhALR可通过保护及改善梗阻性黄疸肝细胞线粒体结构及功能，从而达到保护及改善梗阻性黄疸肝功能、促进胆管再通后肝功能恢复的目的。    分析其原因，可能与ALR可诱导肝细胞线粒体转录因子A(mitochondrial transcription factor A，TFAM)基因的表达有关［6］。TFAM是影响细胞线粒体DNA(mitochondrial DNA，mtDNA)的一个重要因素，它可以促进mtDNA的转录及表达［7-8］，提高mtDNA的拷贝数量［9］，修复受损的mtDNA，恢复mtDNA的完整性［10］。而mtDNA编码了线粒体内众多与线粒体氧化磷酸化有关的蛋白，是决定线粒体功能的一个重要因素［11］。因而我们推测，对梗阻性黄疸大鼠给予rhALR后，可通过TFAM途径，影响mtDNA，从而保护及改善梗阻性黄疸肝细胞线粒体功能，达到保护及改善梗阻性黄疸大鼠肝功能，促进胆管再通后肝功能恢复的目的，为梗阻性黄疸的围手术期处理提供帮助。【参考文献】［1］ Spivey J R, Bronk S F, Gores G J. Glycochenodeoxychlateinduced lethal hepatocellular injury in rat hepatocytes. Role of ATP depletion and cytosolic free calcium［J］. J Clin Invest,1993,92(1):17-24.［2］ Kaplowitz N. Mechanisms of liver cell injury ［J］. J Hepatol,2000,32(1 Suppl):39-47.［3］ 安永，别平，陈莉，等.梗阻性黄疸血清内毒素水平与生长激素/生长激素结合蛋白的关系［J］.中国现代医学杂志，2001，11(6):22-25.［4］ Hagiya M, Francavilla A, Polimeno L, et al. Cloning and sequence analysis of the rat augmenter of liver regeneration(ALR) gene: Expression of biologically active recombination ALR and demonstration of tissue distribution［J］. Proc Natl Acad Sci USA,1994,91(17):8142-8146.［5］ 张丽梅，刘殿武，杨洁.大鼠肝再生增强因子真核表达质粒对急性肝损伤的治疗作用［J］.疾病控制杂志，2004，8(5)：425-428.［6］ HernandezMunoz R, SanchezSevilla L, MartinezGomez A, et al. Changes in mitochondrial adenine nucleotides and in permeability transition in two models of rat liver regeneration［J］. Hepatology,2003,37(4):842-851.［7］ Sheehan T E, Kumar P A, Hood D A, et al. Tissuespecific regulation of cytochrome c oxidase subunit expression by thyroid hormone［J］. Am J Physiol Endocrinol Metab,2004,286(6):E968-974.［8］ Garstka H L, Schmitt W E, Schultz J, et al. Import of mitochondrial transcription factor A (TFAM) into rat liver mitochondria stimulates transcription of mitochondrial DNA［J］. Nucleic Acids Res,2003,31(17):5039-5047.［9］ Ekstrand M I, Falkenberg M, Rantanen A, et al. Mitochondrial transcription factor A regulates mtDNA copy number in mammals［J］. Hum Mol Genet,2004,13(9):935-944.［10］Suliman H B, Carraway M S, Piantadosi C A. Postlipopolysaccharide oxidative damage of mitochondrial DNA［J］. Am J Respir Crit Care Med,2003,167(4):570-579.［11］Wallace D C. Mitochondrial diseases in man and mouse［J］. Science,1999,283(5407):1482-1488.