联合应用SSH和cDNA表达谱芯片筛选肝星状细胞早期活化的相关基因
发表时间：2010-02-25 浏览次数：535次
联合应用SSH和cDNA表达谱芯片筛选肝星状细胞早期活化的相关基因作者：何天霖 吴志勇 罗蒙 邱江锋 作者单位：1 200127 上海交通大学医学院仁济医院普外科； 2 200433 上海，第二军医大学长海医院普外科 【摘要】 目的 利用抑制消减杂交(suppression subtractive hybridization，SSH)和cDNA表达谱芯片筛选早期活化的肝星状细胞(hepatic stellate cell,HSC)和大鼠正常肝脏组织、轻度肝纤维化组织、重度肝纤维化组织中差异表达的基因。方法 从SSH构建的大鼠轻度肝纤维化、重度肝纤维化2个差异cDNA文库中挑选1 000条上调显著的基因，与正常大鼠4 136条基因克隆制作成一张芯片，筛选早期活化的肝星状细胞相关基因。结果 获得与HSC早期活化相关的上调基因有202条，下调基因有80条，其中血清和糖皮质激素调节蛋白激酶(serum and glucocorticoid sensitive kinase,SGK)在正常大鼠基因克隆和2周及8周SSH上调差异基因中均呈上调信号。结论 联合应用SSH和cDNA表达谱芯片是筛选和鉴定不同样本中差异表达基因的快速、经济和有效的方法；SGK可能作为多种细胞信号传导通路和细胞磷酸化级联反应的一个功能性交汇点，参与了肝星状细胞的早期活化和信号传导。 【关键词】 肝星状细胞 抑制消减杂交 cDNA表达谱芯片 肝纤维化 血清和糖皮质激素调节蛋白激酶 Identification of initiative activation related genes of hepatic stellate cell by combining SSH and cDNA microarray HE Tianlin, WU Zhiyong, LUO Meng, QIU Jiangfeng. Department of General Surgery, Renji Hospital, School of Medicine, Shanghai Jiaotong University, Shanghai 200127, China 【Abstract】 Objective To identify initiative activated genes of hepatic stellate cell in normal hepatic tissues, slight liver fibrosis tissues and severe liver fibrosis tissues by using suppression subtractive hybridization (SSH) and cDNA microarray. Methods Initiative activated genes of hepatic stellate cell was identified by selecting 1 000 genes with obvious upregulation from two cDNA libraries of slight liver fibrosis and severe liver fibrosis to clone with 4 136 genes from normal rats for making a chip. Results We obtained 202 cDNAs with upregulated expression and 80 cDNAs with downregulated expression. The glucocorticoid sensitive kinase (SGK) gene showed to be upregulated among normal hepatic tissues, slight liver fibrosis tissues and serious liver fibrosis tissues. Conclusions The combination of SSH and cDNA microarray is a rapid and effective method to screen and identify differentially expressed genes in different samples. As a functional converge site for signal transduction pathway of many cells and cascade reaction of cell phosphorylation, SGK gene plays a key role in initiative activation and signal transduction of hepatic stellate cells. 【Key words】 Hepatic stellate cells; Suppression subtractive hybridization; cDNA microarray; Liver fibrosis; Serum and glucocorticoid sensitive kinase 肝炎后肝硬化所致的门静脉高压症是我国的常见疾病，而肝纤维化是其发展过程中最主要的环节。大量的研究表明，肝星状细胞(hepatic stellate cell,HSC)激活并转化为肌成纤维样细胞是肝纤维化发生中的核心环节。迄今为止，国内外鲜见有关HSC在其早期激活阶段的基因差异表达研究。因此， 本研究在肝纤维化形成和逆转的不同时期及在应用血小板源性生长因子(platelet derived growth factor,PDGF)刺激因子作用下，联合应用抑制消减杂交(suppression subtractive hybridization，SSH)和cDNA表达谱芯片筛选与肝星状细胞早期活化密切相关的基因，探讨HSC在肝纤维化不同过程中差异基因的表达，为进一步研究HSC的激活与凋亡机理及其在肝纤维化发生发展和逆转中的作用提供理论基础，为临床能更好的开发研究相应药物早期干预、防治肝纤维化提供重要实验依据。1 材料与方法 1.1 抑制消减杂交 100% CCl4与植物油1∶1混合，每周2次2 μl/g皮下注射。2周和8周后分别形成轻度肝纤维化和重度肝纤维化大鼠模型。肝纤维化组织及正常肝组织总RNA分离提取,应用甲醛变性凝胶电泳鉴定总RNA完整性,取等量的肝纤维化组织和正常肝组织的总RNA分步纯化mRNA。用核酸光谱定量仪测mRNA浓度和纯度。以肝纤维化组织的mRNA作为实验方(tester)，正常肝组织mRNA为参照方(driver)。首先合成双链cDNA，取各组mRNA各2 μg分别与1 μl cDNA合成引物混合，在AMV反转录酶作用下合成第一链cDNA。在第一链合成反应液中加T4聚合酶，合成双链cDNA。抽提并沉淀cDNA，将沉淀物溶于50 μl灭菌水中。双链经RsaⅠ酶切，产生相对较短的平端片段，纯化酶切产物。将tester的cDNA分为两份，分别连接试剂盒提供的特殊设计的寡核苷酸接头Adapter 1和Adapter 2，然后与过量的driver cDNA进行杂交；合并两种杂交产物后再与driver cDNA作第二次杂交；然后将杂交产物做2轮选择性PCR扩增，使仅在tester cDNA中特异性高表达片段得到特异性扩增。扩增产物与pGEMT载体连接，转化DH5α感受态细菌，在含氨苄青霉素的LB培养板上，37 ℃培养18 h。挑取白色菌落，增菌，以pGEMTeasy载体多克隆位点两端引物进行菌落PCR扩增，产物经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定，证明含有插入片段(200～1 000 bp)后测序。将测得的基因片段序列与GenBank数据库进行同源性比较分析。 1.2 芯片制作 挑取3个文库中的白色克隆并分配克隆号，在5 ml LB培养基中37 ℃振摇培养过夜。然后取1 μl培养液作模板，以pGEMT的一对通用引物T7/SP6扩增外源插入片段。PCR扩增条件为94 ℃30 s、55 ℃ 30 s、65 ℃ 30 s，30次循环。反应完毕，取4 μl产物于1.0%琼脂糖凝胶中电泳，观察有无特异扩增片段。对于有扩增片段的用QIAquick PCR Purification Kit(QIAGEN公司)纯化、真空抽干，最后以0.5 g/L的浓度溶于50%的DMSO中，在95 ℃变性5 min后，迅速置冰上，然后各取10 μl移入384孔板并用点样仪点布于醛基化修饰的玻璃片。 1.3 组织来源 肝星状细胞原代分离、培养后，用PDGFBB刺激，终浓度为20 ng/ml，HSC细胞刺激15 min后，胰蛋白酶消化收获细胞。 1.4 RNA提取和探针制备 去除培养液，用PBS缓冲液快速洗一次，离心除去PBS 缓冲液，利用TRiZol总RNA提取试剂分离早期活化HSC的总RNA，分光光度计测浓度和纯度，取总RNA 5 μg在甲醛琼脂糖凝胶中电泳。按照RTL DPCR方法进行探针标记，具体方法为：①第一条链的合成：取0.05～0.1μg总RNA、1 μl 3'端反转录引物、1 μl 5'端引物于一离心管中，加蒸馏水补充至5 μl，轻轻混匀，离心后置72 ℃水浴2 min，然后置于冰上。再次离心并加入如下组分：2 μl 5×第一链buffer、1 μl dNTP、1 μl DTT、1 μl MMLV反转录酶，混匀并离心，于PCR仪上42 ℃反应1 h后，置于冰上终止反应；②探针标记PCR反应体系：加2 μl第一链cDNA、4 μl LDPCR引物、2 μl 50×dNTP mix、1.2 μl CydCTP、10 μl 10×Advantage 2 PCR buffer、78.8 μl DEPC处理过的水、2 μl 50×Advantage 2 Polymerase Mix于一离心管中，置PE9600或2400 PCR仪上按如下条件反应：95 ℃ 5 s、65 ℃ 5 s、68 ℃ 6 min，13个循环。标记后的PCR产物用QIAquick PCR Purification Kit纯化、真空抽干，溶于50 μl水中。 1.5 杂交及洗片 根据杂交面积大小，取15 μl标记探针在100 ℃变性5 min后，迅速置冰上，然后加入35 μl UniHyb杂交液并混匀。用移液器将探针迅速移于基因芯片上并用盖玻片轻轻盖住，置杂交盒内于62 ℃杂交8～10 h。杂交完毕，分别用1×SSC、0.1% SDS，0.1×SSC、0.1% SDS，0.1×SSC和蒸馏水各清洗2 min。 1.6 图像扫描及分析 芯片置ScanArray 4000扫描仪内扫描，Genepix pro3.0软件分析和处理数据。 1.7 部分克隆的测序 在实验1.6的基础上选取8个差异表达的克隆进行测序。将8个克隆分别培养后，各取0.5 ml菌液送上海欧易生物工程公司测序。2 结果 2.1 SSH结果 早期和重度肝纤维化差异cDNA(见图1、2)。菌落PCR扩增结果显示100～1000 bp大小不等的插入片段，所获得的1 152个克隆中有1 036个含有插入片段。这些条带可能代表差异表达的基因片段。 2.2 早期活化HSC总RNA提取 提取的织总RNA经1%甲醛琼脂糖凝胶电泳后可以清晰地看到18 S RNA、28 S RNA，说明RNA 没有降解。 2.3 芯片杂交结果 标记探针与3个文库的芯片杂交后，早期活化的HSC的RNA样本双色荧光标记叠加图及杂交信号强度散点图见图3A、B 。杂交结果经过GenePix Pro 3.0软件分析和数据处理后，以表达量高于对照组2倍以上即为差异表达基因的初选，其中与HSC早期活化相关的上调基因有202条，其中轻度肝纤维化文库中2条，重度肝纤维化文库中47条，正常大鼠肝脏基因文库中153条；下调基因有80条，其中轻度肝纤维化文库中17条，重度肝纤维化文库中3条，正常大鼠肝脏基因文库中60条。 某一点的两种叠加荧光信号：如果CY3信号较强，该点多显绿色(下调趋势)；如果CY5信号较强，该点多显红色(上调趋势) ；如果强度相似，即显黄色。图3B中，X轴、Y轴分别以CY3荧光强度值(前景值－背景值)和CY5荧光强度值为坐标，每一个数据点代表芯片上一个基因点的杂交信号；数据点若为红色，则代表Y值与X值的比值在0.5～2.0之间，基本属非差异表达；数据点若为黄色，则代表Y值与X值的比值在0.5～2.0范围之外(该点很可能属于表达差异)。 2.4 测序结果 选取轻度肝纤维化文库中2个差异表达，重度肝纤维化文库中荧光强度最高的6个差异表达进行测序，与已知序列的正常大鼠文库比对，发现细胞内视黄醇结合蛋白(cellular retionalbinding protein,CRBP)、血清和糖皮质激素调节蛋白激酶(serum and glucocorticoidregulated prote in kinase,SGK)在上述3个文库中均显著增高。3 讨论 肝星状细胞被认为是细胞外基质(extracellular matvix,ECM)的主要来源细胞或称ECM产生细胞。HSC激活机制的研究中发现，HSC的激活过程是肝脏胶原产生和肝纤维化形成的中心环节。HSC活化有两个阶段：初始的启动阶段和以后的持续阶段。启动阶段主要为早期的基因表达的改变和在刺激因素作用下细胞表型的改变，主要依赖于旁分泌的刺激。 我们用CCl4制备大鼠肝纤维化模型，在肝纤维化形成的不同时期(CCl4注射后2、8周，配合连续病理切片、免疫组化判断不同病期)与对照组(注射生理盐水)分别进行SSH，建立2个差异cDNA文库，接着在2个文库中挑选1 000条上调差异基因与4 136条正常大鼠肝脏基因定制基因芯片。用PDGF刺激原代培养的HSC，分为对照组(静止HSC)，早期活化组(刺激15 min后换液，抽提总RNA，反转录标记CY3、CY5，建立cDNA文库，与定制的基因芯片进行探针杂交)。在这种联合SSH和基因芯片技术筛选和HSC早期激活最有关联的差异表达基因中发现，CRBP1基因和SGK在3个cDNA文库中均明显上调。检测出这些差异表达，有望揭示肝星状细胞早期活化过程的机制，为进一步研究HSC的激活与凋亡机理及其在肝纤维化发生发展和逆转中的作用地位提供线索。 HSC活化，其核心环节中的特征性表现就是核周围视黄醇(维生素A)脂滴的消失。但国内外有关HSC早期激活阶段视黄醇代谢途径的研究鲜有报道。早期干预HSC活化阶段视黄醇代谢途径可将是抗纤维化治疗的一个重要方向。HSC的活化是否必须有视黄醇类的消失?哪一类视黄醇能促进或抑制体内HSC活化?视黄醇类是否在肝纤维化过程中起到关键作用等，都是需要进一步探讨的问题。这些问题的阐明对于临床上治疗肝纤维化具有重要意义［1-5］。 2002年Uchio在用CCl4制备大鼠肝纤维化模型中发现，活化第5天的HSC中CRBP1表达明显增加，而视黄醇脂滴消失，提示CRBP1与肌成纤维样细胞的形成密切相关。2004年Lepreux在人肝纤维化的研究中也发现了这种同样的现象，提示CRBP1基因是肝星状细胞活化信号通路中重要组成部分［6-7］。与我们的实验结果相同。 由于CRBP1基因和肝星状细胞活化信号通路的调控关系比较复杂，要明确其在肝纤维化发生、发展过程中CRBP1基因变化所产生的影响，还需要更多的探索和研究。 SGK是在con8.6d6大鼠乳腺癌细胞中，通过糖皮质激素诱导转录表达的差异筛选发现的。当细胞受糖皮质激素或血清刺激，SGK基因在30 min内表达迅速升高5～10倍。该酶基因全长2.4 kb，编码为一49×103的蛋白激酶，从酵母到人类呈高度保守，在各种哺乳动物组织和细胞系中均有表达。SGK是一个与PKB/AKT等第二信使蛋白具有极高的同源性的Ser/Thr蛋白激酶。与目前已发现的绝大多数蛋白激酶只受磷酸化/去磷酸化调节机制显著不同的是，SGK还存在快速转录水平上的调节机制。它可能作为多种细胞信号传导通路和细胞磷酸化级联反应的一个功能性交汇点，参与离子通道调节、细胞增殖、存活的信号传导。 RasRafMEKERK信号传导通路在细胞增殖、生长、分化中起重要作用。Raf蛋白是这一信号传导通路重要成员之一。它受多种因素的调节，其中PKC Sac可通过磷酸化对其正调节，而PKB/AKT通过磷酸化对其负调节。SGK可通过磷酸化BRaf上的Ser抑制其活性，并且它对BRaf的抑制作用比PKB/AKT更强。这表明SGK是一个对持续性RasRafMEKERK级联的负反馈调节环节，它可能调控着BRaf与其他信号通路的相互交连，是信号传递系统相互作用沟通的交汇点［8-10］。【参考文献】［1］ Wells R G. The role of matrix stiffness in hepatic stellate cell activation and liver fibrosis［J］. J Clin Gastroenterol,2005,39(4):S158-161.［2］ Carpino G, Franchitto A, Morini S, et al. Activated hepatic stellate cells in liver cirrhosis. A morphologic and morphometrical study［J］. Ital H Anat Embryol,2004,109(4):225-238.［3］ Mazzocca A, Sciammetta S C, Carloni V, et al. Binding of hepatitis C virus envelope protein E2 to CD81 upregulates matrix metalloproteinase2 in human hepatic stellate cells［J］. J Biol Chem,2005,280(12):11329-11339.［4］ Goto T, Mikami K I, Miura K, et al. Mechanical stretch induces matrix metalloproteinase 1 production in human hepatic stellate cells［J］. Pathophysiology,2004,11(3):153-158.［5］ Schnabel C, Sawitza I, Tag C G, et al. Expression of cytosolic and membrane associated tissue transglutaminase in rat hepatic stellate cells and its upregulation during transdifferentiation to myofibroblasts in culture［J］. Hepatol Res,2004,28(3):140-145.［6］ Uchio K. Cellular retinolbinding protein1 expression and modulation during in vivo and in vitro myofibroblastic differentiation of rat hepatic stellate cells and portal fibroblasts［J］. Lab Invest,2002,82(5):619-628.［7］ Lepreux S. Cellular retinolbinding protein1 expression in normal and fibrotic/cirrhotic human liver:different patterns of expression in hepatic stellate cells and myofibroblast subpopulations［J］. J Hepatol,2004,40(5):774-780.［8］ Khan Z A, Barbin Y P, Farhangkhoee H, et al. Glucoseinduced serumand glucocorticoidregulated kinase activation in oncofetal fibronectin expression［J］. Biochem Biophys Res Commun,2005,329(1):275-280.［9］ Waerntges S, Klingel K, Weigert C, et al. Excessive transcription of the human serum and glucocorticoid dependent kinase hSGK1 in lung fibrosis［J］. Cell Physiol Biochem,2002,12(2-3):135-142.［10］Feng Y, Wang Q, Wang Y, et al. SGK1mediated fibronectin formation in diabetic nephropathy［J］. Cell Physiol Biochem,2005,16(4-6):237-244.
