核转录因子KLF6在非酒精性脂肪性肝纤维化形成中的作用

核转录因子KLF6在非酒精性脂肪性肝纤维化形成中的作用作者：王晓敏 陈东风　　    作者单位：400042 重庆，第三军医大学大坪医院野战外科研究所消化内科    【摘要】  目的 研究大鼠非酒精性脂肪性肝纤维化形成过程中，肝脏核转录因子KLF6及相关基因表达变化及其作用。方法 建立高脂饮食脂肪性肝纤维化模型，用RTPCR与免疫组织化学法观察肝组织中KLF6、TGFβ1、αSMA表达变化，放射免疫法检测血清肝纤维化指标HA、LN、CⅣ。结果 模型组大鼠高脂喂养8周呈现单纯性脂肪变，肝脏KLF6、TGFβ1、αSMA的mRNA表达与正常对照组相比差异无统计学意义(P>0.05)。12周时随着脂肪变的加重，KLF6 mRNA表达上调(0.62±0.10,P<0.01)，于16周达高峰(1.01±0.07，P<0.01)，24周略有回落(0.81±0.08，P<0.01)；而TGFβ1和αSMA的mRNA表达于16周时开始增高(0.62±0.19、0.77±0.12，P<0.01)，24周达高峰(0.91±0.07、1.08±0.19，P<0.01)。相关分析发现，KLF6与TGFβ1、αSMA表达以及肝纤维化分级评分之间呈显著正相关(r=0.848、0.859、0.706，P<0.01)。结论 高脂饮食引起KLF6表达增强，最初可能是一种适应性反应，随着其表达进一步增强，可引起TGFβ1和αSMA表达持续上调，从而促进脂肪性肝纤维化的发生、发展。     【关键词】  KLF6 转化生长因子β1 平滑肌肌动蛋白 非酒精性脂肪性肝病 肝纤维化     Role of Kruppellike factor 6 in development of nonalcoholic fatty liver fibrosis in rats  WANG Xiaomin, CHEN Dongfeng. Departerment of Internal Medicine, Reseach Institute of Surgery, Daping Hospital, Third Military Medical University, Chongqing 400042, China    【Abstract】  Objective  To study the expression and significance of Kruppellike factor 6 (KLF6) and relative genes during the course of development of nonalcoholic fatty liver fibrosis in rats. Methods  A rat fatty liver fibrosis model was established by a high fat feeding to observe expression changes of KLF6, transforming growth factor β1 (TGFβ1) and αSMA by immunohistochemistry and RTPCR. In the meantime, HA, LN and CIV were detected by means of radioimmunity. Results  At the 8th week in high fat feeding group, there was found fatty livers, with insignificant difference in aspects of expressions of KLF6, TGFβ1 and αSMA mRNA compared with control group (P＜0.05). Expression of KLF6 mRNA was upregulated to (0.62±0.10, P<0.01) with appearance of fatty hepatitis at the 12th week, reached peak at (1.01±0.07) at the 16th week (P<0.01) and decreased slightly to (0.81±0.08) at the 24th week (P＜0.01). Whereas, expressions of TGFβ1 and αSMA mRNA began to upregulate to (0.62±0.19, 0.77±0.12) at the 16th week (P＜0.01) and reached peak at (0.91±0.07, 1.08±0.19) at the 24th week (P<0.01). KLF6 was closely correlated with expressions of TGFβ1 and αSMA and with scoring of hepatic fibrosis (r=0.848, 0.859, 0.706，P<0.01). Conclusion  The high expression of KLF6 at the early stage induced by high fat feeding is an adaptive reaction of the body and, with the advanced expression of withKLF6, can lead to continuous expression upregulation of TGFβ1 and αSMA and hence promote development of fatty fibrosis.    【Key words】  Kruppellike factor 6; Transforming growth factor β1; αsmooth mucle actin; Nonalcoholic fatty liver disease; Liver fibrosis    肝纤维化是肝脏对各种慢性损伤疾病的一种修复应答反应，具有可逆性。细胞因子网络调控的肝星状细胞(hepatic stellate cell，HSC)活化是肝纤维化形成的主要发病机制。体内外实验证明在HSC的活化过程中相关细胞/生长因子的转录均受相应的核转录因子的调控。已知在肝纤维化发生过程中转化生长因子β1(transforming growth factor β1,TGFβ1)是最主要的促纤维生成因子，可使肝星状细胞激活并分泌大量胶原纤维。目前有关TGFβ1及其下游信号通路的研究较多，而对其上游调控基因在纤维化形成中的表达研究较少。研究发现核转录因子KLF6(kruppellike factor 6)是一种损伤后修复基因，对TGFβ1及其受体具有反式激活作用［1］，很可能是调节HSC激活过程中TGFβ1自分泌环的重要因子。因此本实验通过观察TGFβ1及其上游调节基因KLF6在脂肪性肝纤维化形成中的动态变化，初步探讨KLF6在脂肪性肝纤维化形成中的作用和机制。1  材料与方法    1.1  材料    胆固醇和胆盐购自重庆市医药公司生化试剂公司； 透明质酸(HA)、 层黏连蛋白(LN)、 Ⅳ型胶原(CⅣ)放射免疫试剂盒购自北京北方生物技术研究所；Tripure购自上海罗氏公司；RTPCR试剂盒购自大连宝生物公司；PCR Marker购自Takara公司；焦磷酸二乙酯(DEPC)购自Sigma公司；KLF6兔多克隆抗体购自Satan公司；平滑肌肌动蛋白(αsmooth mucle actin,αSMA)小鼠单克隆抗体购自武汉博士德。    1.2  方法    1.2.1  动物模型［2］    雄性Wistar大鼠40只购自第三军医大学大坪医院实验动物中心,体重180～200 g。正常喂养1周后，随机分为2组。对照组(C组)8只以普通饲料喂养，16周处死。模型组(F组)32只以2%胆固醇＋15%猪油＋0.5%胆盐＋82.5%普通饲料构成高脂饲料喂养，建立实验性脂肪性肝纤维化动物模型。分别于8、12、16、24周以速眠新1 ml/kg麻醉大鼠，腹主动脉采血，肝右叶中部切取2块肝组织，1块为1 cm×0.5 cm×0.5 cm大小，用4%聚甲醛固定制备石蜡切片，另1块为0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm大小，置于-70 ℃冰箱储存， 用于RTPCR检测。    1.2.2  血清学指标    血清TG、FFA、ALT、AST采用全自动生化分析仪检测。放射免疫法检测血清HA、LN、CⅣ，严格按试剂盒说明书进行操作。    1.2.3  组织病理学    4%聚甲醛固定肝组织，石蜡包埋，常规苏木精伊红(HE)染色，病理分级分期参照文献［3］；Masson染色观察有无肝纤维化并分级，依据纤维化的范围和程度将脂肪性肝纤维化分为5级，S0：无纤维化；S1：腺泡带局灶性或广泛的窦周/细胞周纤维化；S2：纤维化扩展到门管区星芒状纤维化；S3：纤维化扩展到门管区周围，局灶性或广泛的的桥接纤维化；S4：肝硬化。肝纤维化分级评分标准：S0 0分；S1 1分；S2 2分；S3 3分；S4 4分。    1.2.4  免疫组化    肝组织石蜡切片常规脱蜡至水，3%过氧化氢阻断内源性过氧化物酶，PBS洗3次，pH8.0 EDTA微波修复，滴加不同稀释浓度的一抗(KLF6 1∶200，αSMA 1∶50)后4 ℃过夜，次日滴加二抗，37 ℃孵育1 h后DAB显色，经苏木素复染，稀盐酸酒精分色后封片观察，每次实验均设阴性对照，以磷酸盐缓冲液代替一抗。每例均随机观察5个高倍视野，读取阳性细胞数。    王晓敏，等. 核转录因子KLF6在非酒精性脂肪性肝纤维化形成中的作用  1.2.5  KLF6、TGFβ1、αSMA mRNA检测    肝组织总RNA的提取，按Tripure试剂盒说明进行操作，最后加入DEPC去离子水20 μl重新溶解RAN，待用。RNA样品的纯度根据260 nm及280 nm吸光值的比值(A260/280)来计算，比值在1.6～2.0之间。RNA样品的电泳鉴定：取用1%甲醛变性琼脂糖凝胶，10 μg RAN样品电泳，紫外观察，如28 S、18 S、5 S rRAN带清晰可见，带与带之间无明显脱尾则表明RAN无明显降解，可用于RTPCR分析。    1.2.6  引物设计    利用引物设计软件设计各引物。KLF6上游引物为5'TGCCTGGAGTTGGAACGCTATC3'，下游引物为5'TGCTTTCGGAAGTGTCTGGTC3'，扩增片段656 bp；TGFβ1上游引物为5'ACCGCAACAACGCAATCTATG3'，下游引物为5'ATTCCGTCTCCTTGGTTCAGC3'，扩增片段298 bp；αSMA上游引物为5'AGGGACTAATGGTTGGAATGG3'，下游引物为5'CAATCTCACGCTCGGCAGTAG3'，扩增片段504 bp；内参照βactin上游引物为5'GCTGTGCTATGTTGCCCTAGACT3'，下游引物为5'CGGACTCATCGTACTCCTGCTTG3'，扩增片段453 bp。    1.2.7  RTPCR检测    反应分两步进行，取总RNA 5 μg， 在AMV逆转录酶作用下逆转录为cDNA，以此为模板，分别按以下条件进行PCR反应，扩增KLF6：94 ℃变性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，34个循环，最后72 ℃延伸10 min。扩增TGFβ1和αSMA：94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，34个循环，最后72 ℃延伸10 min。PCR产物5 μl在2%琼脂糖凝胶上进行电泳。凝胶电泳后，于Gel Doc2000凝胶图像分析系统进行扫描，用BandScan软件分析，测定产物条带的IOD，以βactin为基准，做半定量分析，即以扩增目的片段βactin的灰度值表示所扩增的目的基因片段的相对表达水平。    1.3  统计学处理    实验数据采用SPSS 10.0统计软件处理，组间差异采用单因素方差分析(oneway ANVOA)；相关性分析采用Pearson Correlation方法；多元线性回归采用enter方法。P<0.05表示差异有统计学意义。2  结果    2.1  病理学观察    光镜下，对照组肝细胞以中央静脉为中心呈放射状排列，肝细胞形态规则，胞质丰富，细胞核圆形(图1、2)。高脂喂养8周组，部分肝细胞内有脂肪滴沉积，细胞质疏松或肿胀，肝窦变窄，未见炎细胞浸润；12周组，肝细胞脂肪变加重并出现气球样变和汇管区少量炎细胞浸润，散在点状坏死，Masson染色可见少量胶原于窦周沉积增加；16周组肝细胞气球样变加剧，以腺泡3带明显，腺泡内点状坏死，门管区轻至中度炎症，Masson染色可见窦周、细胞周纤维组织增生；24周组，肝细胞脂肪变性、炎细胞浸润较16周组有所减轻，但出现明显纤维组织增生。模型组大鼠均可见窦周纤维化，2例可见门管区星芒状纤维化，1例出现桥接纤维化(图3、4)。肝纤维化分级评分见表1。 表1  肝组织纤维化分级评分    2.2  脂肪性肝纤维化形成过程中血清TG、FFA及肝功能指标的动态变化    与对照组相比，模型组大鼠血清TG、FFA、AST、ALT等均较对照组显著增高，检测结果见表2。    2.3  脂肪性肝纤维化形成过程中血清肝纤维化指标的动态变化    随着脂肪性肝纤维化的进展，血清肝纤维化指标HA、LN和CⅣ水平呈逐渐增高趋势，其中HA于高脂12周明显增高(86.45±11.94，P<0.05)，LN和CⅣ则分别于16周末开始增高，24周时HA、LN和CⅣ与对照组相比，差异均有统计学意义，检测结果见表3。表2  大鼠血清TG、FFA及肝功能指标的动态变化表3  大鼠血清肝纤维化指标的动态变化    2.4  肝组织中KLF6和αSMA的免疫组化    2.4.1  KLF6的免疫组化染色(PV染色)    正常大鼠肝脏几乎未见KLF6呈阳性反应的细胞(图5)。在模型组12、16、24周大鼠肝组织KLF6阳性反应的部位，主要在肝细胞核，呈棕黄色及棕褐色阳性表达，随病变的发展染色逐渐加深且阳性细胞数量增多(图6)。    2.4.2  αSMA的免疫组化染色(SABC染色)    对照组大鼠肝组织αSMA只分布于血管壁平滑肌(图7)。模型组αSMA除血管平滑肌表达外，16周时靠近中央静脉和窦周处可见散在少量αSMA表达，24周汇管区、纤维间隔和Disses间隙阳性细胞数增多且染色加深(图8)。    2.5  肝组织中KLF6、TGFβ1、αSMA mRNA的动态变化    与正常大鼠相比，高脂饮食12周时KLF6的基因转录水平稍有增加，此时尚未见TGFβ1和αSMA的变化；第16周时KLF6表达最强，TGFβ1和αSMA也均明显上调；而第24周时KLF6表达略有下降，但与对照组比较差异有统计学意义(P<0.01)。而TGFβ1和αSMA的表达则持续上调。各阶段灰度扫描和βactin比值与对照组比较，差异有统计学意义(P＜0.05)。见表4和图9～11。表4  各组大鼠肝组织中KLF6、TGFβ1、αSMA mRNA RTPCR产物光密度(A值)比较    2.6  肝组织KLF6 mRAN表达与脂肪性肝纤维化形成的关系    多因素相关分析发现KLF6 mRAN表达与TGFβ1和αSMA mRAN以及脂肪性肝纤维化分级评分均呈显著正相关，r=0.848、0.859、0.706，P<0.01。多元回归分析发现，血清TG、FFA增高是影响KLF6 mRAN表达的主要因素，t＝2.68、2.47，P<0.01。3  讨论    非酒精性脂肪性肝纤维化发生、发展的机制目前尚不完全清楚。但在脂肪肝的基础状态(第一次打击)上附加某种肝细胞损伤因子(第二次打击)而演变为脂肪性肝炎肝纤维化的“二次打击学说”(two hit theory)最受支持［4］。最近有学者提出肝脂肪变性和细胞因子状态即使无炎症，其活性氧的生成亦过剩，可导致慢性氧化应激和慢性损伤修复反应，从而促进脂肪性肝纤维化的发生、发展，最终可致肝癌。而往往又因其炎症反应不明显呈隐匿性进展过程，容易被忽视。    尽管肝纤维化形成的产生有着共同的机制，但在不同肝病时肝内纤维生成的区域和肝纤维化的形成模式却不尽相同。这提示不同的致病因素引起的肝纤维化可能具有其特异性的调节机制。脂肪性肝纤维化以细胞周围型纤维化为主，主要由肝星状细胞产生纤维，形成肝窦毛细血管化，主要机制为氧化应激和慢性炎症损伤修复反应，多见于酒精性和非酒精性脂肪性肝炎。    KLF6/ZF9基因是1998年纽约Mount Sinai的Friedman研究小组利用消减杂交技术克隆到的大鼠肝星状细胞激活的早期诱导基因，随后在人类找到与其基因序列几乎完全相同的对应基因。该基因具有典型的DNA结合域及转录激活域，是典型的立即早期基因(immediete early gene)。激活后能移位入核反式，作用于富含GC盒的DNA序列结合元件的启动子，在转录水平调控其下游多种靶基因的表达。近来研究已发现的靶基因有：转化生长因子TGFβ1和TGFβ Ⅰ、Ⅱ型受体、Ⅰ型胶原α基因、胶原合成的分子伴侣HSP47、p21、诱生型一氧化氮核酶(iNOS)等。它们能参与机体损伤修复、细胞周期调控、凋亡等多种生物学行为［5-9］。    我们的研究发现，C组大鼠肝组织中KLF6的mRNA表达极微弱，免疫组化染色未见阳性蛋白表达。F组大鼠8周时血清TG、FFA开始增高，肝脏病理HE染色可见明显肝细胞浊肿和脂肪浸润，呈单纯性脂肪变表现，此时KLF6、TGFβ1和αSMA表达与C组比较无统计学意义。12周时，随血清TG、FFA的进一步增高，KLF6mRNA和蛋白表达上调，且蛋白表达主要定位于肝细胞核。同期可见血清AST、HA出现增高，与C组比较差异有统计学意义。肝脏病理HE染色示肝细胞重度脂肪浸润，并有少量炎症细胞浸润。这提示单纯高脂诱导的脂肪变性可导致肝细胞损伤，诱发损伤后立即早期基因KLF6的表达参与损伤后修复反应，它可能是肝脏的一种适应性反应。此时未见TGFβ1、αSMA的表达上调。16周末，随着脂肪变性导致的肝损伤程度的进一步加重，KLF6 mRNA和蛋白表达以及血清TG达到高峰，血清AST则继续增高，ALT、LN、CⅣ以及TGFβ1、αSMA的表达亦开始上调，与C组相比差异有统计学意义。肝脏病理HE和Masson染色可见肝细胞高度气球样变和炎细胞浸润、局灶性坏死以及窦周、细胞周轻度胶原沉积，出现早期窦周/细胞周围型纤维化。表明KLF6作为HSC激活立即早期基因在脂肪性肝纤维化早期即明显表达，与脂肪变的肝细胞损伤程度相一致。随着纤维化的进一步发展，至24周时，KLF6表达略有下调，与血清TG表达似乎同步，而此时血清肝纤维化指标以及TGFβ1、αSMA等仍持续增高。肝脏病理HE和Masson染色示肝组织明显纤维化，提示后者与肝纤维化的进一步发展关系更为密切。    研究结果显示：在非酒精性脂肪性肝纤维化形成过程中，KLF6 mRNA于脂肪变早期即12周时便已明显增高，与对照组相比差异有统计学意义(0.62±0.10,P<0.01)，16周时达高峰(1.01±0.07，P<0.01)，24周略有回落(0.81±0.08，P<0.01)；而TGFβ1和αSMA的mRNA表达于16周时开始增高(0.62±0.19、0.77±0.12，P<0.01)，24周纤维形成时达高峰(0.91±0.07、1.08±0.19，P<0.01)，时序上明显落后于KLF6。多因素相关分析发现KLF6 mRAN表达与TGFβ1和αSMA mRAN以及脂肪性肝纤维化分级评分均呈显著正相关。这提示KLF6基因参与了高脂饮食诱导的脂肪性肝纤维化的早期形成过程，其作用很可能是通过调控促纤维生成因子TGFβ1及其诱导HSC的激活而促进脂肪性肝纤维化的发生、发展。提示通过分子生物学手段抑制KLF6的表达将有可能是治疗肝纤维化的又一崭新手段［8］。    研究中我们发现血清TG、FFA与KLF6 mRAN的表达变化趋势基本一致，多因素回归分析发现血清TG、FFA增高是影响KLF6 mRAN表达增高的主要因素(t=2.68、2.47,P<0.01)。我们既往研究证实［10］在非酒精性脂肪性肝病中脂肪酸代谢紊乱导致的FFA增加，一方面对肝细胞有直接毒性，可引起肝细胞膜损伤导致线粒体肿胀变性及通透性增加，促进肝细胞凋亡；另一方面可通过加强脂质过氧化反应，导致炎细胞浸润加重肝细胞损伤程度。本研究进一步证实肝细胞脂肪氧化功能受损导致肝细胞内FFA增多，可能通过KLF6TGFβ1αSMA通路诱发脂肪性肝纤维化的发生。提示肝内脂质本身在一定程度上与脂肪性肝纤维化形成关系密切，但其确切机制尚有待进一步研究。【参考文献】［1］ Botella L M, SanchezElsner T, SanzRodriguez F, et al. 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