胆囊收缩素对人胆管癌细胞粘附、运动及侵袭能力的影响
发表时间：2010-02-22 浏览次数：634次
胆囊收缩素对人胆管癌细胞粘附、运动及侵袭能力的影响张丰深1 郑秀海2 马宽生2 王曙光2【摘要】 目的 研究胆囊收缩素对胆管癌细胞的粘附 、运动以及侵袭行为的影响 。方法 体外 培养人胆管癌细胞系 QBC939 ,应用粘附试验 、Tra nswell 趋化运动和侵袭模型 ,研究 CC K8S 及其不同 浓度下对胆管癌细胞的粘附 、运动以及侵袭能力的影响 。结果 CC K8S 能够以浓度依赖方式降低 QBC939 细胞的粘附 ,而促进其运动和侵袭能力 ,其受体拮抗剂 L 18 和 L 60 能够明显减弱 CC K8S 抑制 QBC939 细胞粘附的作用以及促进瘤细胞运动和侵袭的能力 ,细胞运动和侵袭实验显示 L 60 具有较强 的拮抗 CC K8S 作用的能力 。结论 CC K8S 具有降低 QBC939 细胞的粘附 、促进 QBC939 运动和侵袭的能 力 ,CC K22 受体在影响 QBC939 细胞的运动、侵袭能力方面可能具有较强的作用 。 【关键词】 胆管癌 胆囊收缩素 肿瘤转移Eff ect of cholecystokinin on cell a dhesion , migration and invasion of human bile duct carcinoma Z ha n gFe n gs he n , Z he n g X i u h ai , M a K u ans hen g , W a n g S h u g u an g . De p a rt me nt o f Gene ral S u r ge r y , 324H os p i t al o f PL A , Cho ngqing 400038 , China 【Abstract】 Objective To inve stigat e t he eff ect s of cholecysto kinin o n cell adhesio n , migratio n a nd inva sio n of human bile duct carcino ma cell line QBC939 . Methods Va r ying co ncent ratio ns ofCC K8S and it s recep to r antago ni st s L 18 and L 60 were used to i nve stigate t heir eff ect s o n adhe sio n , mi2gratio n a nd inva sio n of QBC939 . Results CC K8S reduced t he abilit y of adhe sio n a nd increa sed t he a bili2tie s of migratio n a nd inva sio n of QBC939 in do se2dependent manner . L 18 and L 60 rever sed t he eff ect of CC K8S , a nd L 60 had st ro nger eff ect t ha n L 18 o n migratio n a nd inva sio n. Conclusions CC K8S co uld reduce t he a bilit y of adhesio n a nd increa se t he abilitie s of migratio n a nd inva sio n of QBC939 in do se2de2 p endent ma nner . CC K22 recep to r plays mo re significant role t ha n CC K21 in mo dulating migratio n a ndinva sio n of QBC939 . 【Key words】 bile duct ca rcino ma cholecysto kinin meta sta si s 胆管癌细胞易于发生早期多通道远处转移 ,而沿胆管周围神经浸润是胆管癌浸润转移的重要 特点[ 1 ] 。正常情况下 ,内脏神经末梢释放的胆囊收缩素 ( CC K) 能够通过其受体促进胆囊收缩和胃液、胰液等细胞的分泌。研究表明 , CC K 也能 够促进胃癌、胰腺癌、结肠癌等多种消化道肿瘤细胞的生长及运动[ 2 ,3 ] 。本研究以胆管癌细胞 QBC939为研究对象 ,通过观察其对胆管癌细胞的粘附、运 动以及侵袭行为的影响 ,以进一步了解胆管癌细 胞的侵袭转移机制。1 材料与方法1 . 1 材料人胆管癌细胞系QBC939为西南医院全军肝胆外科研究所王曙光教授建株 。N I H3 T3 小鼠成纤维细胞 ,引自西 南医院全军烧伤研究所 。CC K8 S ( Sigma , U SA ) ; L 18 及 L 60 由 Evans B E 教授 ( Merck Co , U SA ) 惠赠 ; 新生牛血 清 ( Gibco , U SA ) ; Ma rigel ( BD , U SA ) ; CC K28 试 剂 盒 (DOJ INDO ,J ap an ) ; R PM I1640 培 养 基 ( Gibco , U SA ) ; Tra nswell小室 ( 膜孔径 12 μm) ( Co star , U SA) ; 市售青霉 素 、链霉素 ; 牛血清白蛋白 (B SA ) ( Gibco , U SA ) ; 酶标仪 (B IO2RAD ,550 型 ,U SA) 。1 . 2 方法1 . 2 . 1 细胞培养 在 37 ℃,相对湿度 100 % , 体积分 数为 50 ml •L - 1 CO2 培养箱中 ,于含 100 ml •L - 1 新生牛血清 , 100 kU •L - 1 青霉素 , 100 mg •L - 1 链霉素的R PM I 1640培养基的条件下培养 ; 每 3 ～4 d 换液一次 ,2 . 5 g •L - 1 胰酶每 6～7 d 消化传代一次 。1 . 2 . 2 趋化因子的制备 N I H3 T3 细胞用含体积分数 为 100 ml •L - 1 新生牛血清的 DM EM 培养液在 37 ℃、50 ml •L - 1 CO2 条件下培养 。在细胞长势良好情况下弃 去培 养 液 , 用 无 血 清 DM EM 轻 洗 2 次 , 加 入 无 血 清DM EM 培养液继续培养 24 h ,收集培养上清液 ,过滤除菌- 20 ℃保存备用 。1 . 2 . 3 粘附实验 参照文献 [ 4 ] 的方法并改良 , 质量浓度 (ρ) 为 2 . 5 g •L - 1 胰酶消化对数生长期 QBC939 细胞 , 无血清 R PM I 1640 培养液调整细胞密度为调至 1 ×105 个细胞/ ml ,100 μl 细胞悬液接种于已铺有 Mat rigel 的 96 孔细胞培养板中 ,分为 3 组 , CC K8S 组分别加入 1 、10 、100 nmol CC K8S ,CC K8S + L 18 组分别加入 1 、10 、100 nmol 相 同浓度的 CC K8S 和 L 18 , CC K8S + L 60 组分别加入 1 、10 、100 nmol 相 同 浓 度的 CC K8S 和 L 60 , 设空 白 对 照 。置37 ℃、50 ml •L - 1 CO2 温育 1 h , 然后弃去培养液 , 用 PB S 洗涤 3 次 , 再加 CC K28 10 μl/ 孔 ,培养 4 h ,酶标检测 仪在 450 nm 处测定吸光值 ( A ) 。每组平行 5 个样本 。1 . 2 . 4 细胞运动和侵袭实验 参照文献 [ 5 ] 的方法 。 细胞运动实验 : 取对数生长期的 QBC939 细胞用质量浓度为 2 . 5 g •L - 1 胰酶消化 , 离心 、洗涤并重悬于无血清的DM EM 培养基中 ,每室加 100μl 1 ×105 个 QBC939 细胞悬液 ,下室加 400 μl 条件培养液 ,分为 3 组 ,CC K8S 组分别在 小室内加入 1 、10 、100 nmol CC K8S , CC K8S + L 18 组分别 在小室内加入 1 、10 、100 nmol 相同浓度的 CC K8S 和 L 18 , CC K8S + L 60 组分别在小室内加入 1 、10 、100 nmol 相同浓 度的 CC K8S 和 L 60 , 设空白对照 。每组平行 5 个样本 。37 ℃、50 ml •L - 1 CO2 温箱内孵育 24 h 。丙酮固定 , H E染色 ,棉签擦去膜内表面未穿过膜的细胞 , 400 倍显微镜 下计数膜上下左右中 5 个不同视野的穿过膜的细胞数 , 以穿膜细胞的相对数目来表示肿瘤细胞的运动能力 。侵 袭实 验 : 用 50 mg •L - 1 Mat rigel 1 ∶8 稀 释 液 包 被 Tra nswell小室底部 ,质量浓度为 10 g •L - 1 B SA 无血清 培养液水化 ,其余步骤同运动实验 。1 . 3 统计学处理 应用 SPSS10 . 0 统计 ,采用 t 检验比较样本均值差异 。2 结果2 . 1 CC K8 S 对 QB C939 细胞粘附能力的影响 实验结果表明 ,1 、10 、100 nmol 不同浓度 CC K8S 能够 降低 QBC939 细胞粘附能力 ,而且 CC K8S 的抑制瘤细胞粘 附的效应与其浓度呈正相关 ,L 18 和 L 60 均能够明显减 弱 CC K8S 的作用 ,但 L18 和 L 60 之间差异不明显。见表 1 。2 . 2 CC K8 S 对 QBC939 细胞运动和侵袭能力的影响 CC K8S 在 1 、10 、100 nmol 不同浓度时 ,能够明显促进QBC939 细胞的运动和侵袭能力 。而 L 18 、L 60 均能够明显减弱 CC K8 S 的作用 ,尤以 L 60 明显 ,说明 CC K22 受体在影 响 QBC939 细胞的运动和侵袭能力具有较 CC K21 重要的作用。见表 2 、3 。3 :组内不同浓度之间比较 P < 0. 05 ; # :组间相同 浓度之间比较 P < 0. 05 ; △:组间相同浓度之间比 较 P < 0. 05 ; ☆:组间相同浓度之间 P > 0. 05 。3 :组内不同浓度之间比较 P < 0. 05 ; # :组间相同 浓度之间比较 P < 0. 05 ; △:组间相同浓度之间比 较 P < 0. 05 ; ☆:组间相同浓度之间 P < 0. 05 。3 :组内不同浓度之间比较 P < 0. 05 ; # :组间相同 浓度之间比较 P < 0. 05 ; △:组间相同浓度之间比 较 P < 0. 05 ; ☆:组间相同浓度之间 P < 0. 05 。3 讨论 肿瘤转移是一个在时间和空间上高度复杂有 序的过程 。在这个过程中 ,肿瘤细胞脱离原发灶 , 通过释放和激活多种蛋白水解酶降解基底膜和细 胞外基质 ,在趋化剂、自分泌以及旁分泌生长因子 等作用下 , 经血管、淋巴管作定向迁移到达靶组 织 ,克隆增殖从而形成转移灶。CC K 在消化道及 神经系统中均具有较高含量 ,其肽能神经纤维在 中枢及消化道内分布广泛 , CC K 通过其受体即 CC K21 受 体 、CC K22/ Ga st ri n 受 体 发 挥 作 用 , CC K21 主要分布在胃肠道 、胰腺、胆道和部分脑 组织 ,而 CC K22/ Ga st ri n 在中枢神经系统及局部 胃肠道分布密度较高[ 3 ] 。 研究发现 CC K 受体结构为具有高度保守性 结构的 7 次跨膜受体 ,受体激活后通过其 C 末端 胞浆域与 IP32Ca2 + 通路[ 5 ] 或 G 蛋白偶联的蛋白 激酶通路[ 6 ] 偶联 ,进而发挥其影响细胞形态结构 、 促进细胞增殖、运动等作用[ 4 ] 。研究还发现多种 肿瘤细胞如胃癌、胰腺癌、结肠癌细胞等存在有 CC K 受体 , CC K 能够促进胰腺癌、结肠癌细胞的 生长 , 通过激活 CC K22/ Ga st ri n 受体能够介导人 结肠肿瘤细胞的浸润转移 , 这种作用可被 CC K 受体拮抗剂所抑制[ 7 ,8 ] , 而且 CC K21 和 CC K22/Ga st ri n 受体具有协同作用 ,二者同时激活能够通 过 G 蛋白信号通路传递更强的细胞生长刺激信 号[ 9 ] 。 既往的研究提示胆管癌细胞 QBC939 有 CC K21 和 CC K22/ Ga st ri n 受体存在 , CC K、Ga st ri n 可促 进其增殖[ 10 ,11 ] 。本研究发现 , CC K8 S 能够呈浓度 依赖方式影响 QB C939 细胞的粘附 、运动和侵袭能 力 ,生理浓度的 CC K8 S 即能够明显降低 QB C939 细 胞的粘附 ,增强其运动和侵袭能力 ,而 CC K21 及 CC K22 受体的拮抗剂 L 18 和 L 60 均能够明显减 弱 CC K8 S 抑制瘤细胞粘附的作用 ,提示 CC K21 及 CC K22 受体对于 QB C939 细胞的粘附均具有重要 作用。本研究还发现 ,外源性的 CC K8 S 与 QB C939 细胞的运动和侵袭能力呈正相关 ,L 18 、L 60 能够 明显减弱 CC K8 S 的作用 , 尤以 L 60 明显。说明 CC K22 受体在影响 QB C939 细胞的运动、侵袭能力方面可能具有较强的作用 ,其作用机制有待于进一步研究。参考文献[ 1 ] 王曙光 ,韩本立 ,陈意生 ,等. 胆管癌转移途径的病理 学研究[J ] . 中华外科杂志 ,1996 ,34 (6) :352 - 354[ 2 ] Baldwin GS. 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