大肠癌多种肿瘤标志物蛋白芯片联合检测及其在诊断中的意义

大肠癌多种肿瘤标志物蛋白芯片联合检测及其在诊 断中的意义牟江洪 　李增鹏 　王东 　马瑜 　肖华亮 　张沁宏　　【摘要】　目的 　研究大肠癌患者血清中多种肿瘤蛋白标志物的改变情况及联合检测在诊断中的 价值 。方法 　采用 C212 多种肿瘤标志物蛋白芯片检测系统测定 139 例大肠癌患者和 63 例大肠良性 病变患者血清中 12 种肿瘤标志物 ( CA1929 ,N S E ,C EA ,CA242 ,CA125 ,CA1523 ,A F P ,f er ritin ,f2PSA , PSA β, 2 HC G 及 H GH) 的水平 ,分析其差异 ,并评估该方法的应用价值 。结果 　在单项指标中 ,大肠 癌患者血清 C EA 、CA1929 、CA242 和 CA125 阳性率分别为 48 . 20 % 、32 . 37 % 、28 . 06 %和 28 . 06 % ,均 显著高于良性病变组 (  P  < 0 . 01) 。采用多项指标判定标准的结果 ,联合检测既可以提高诊断敏感 性 ,也可以获得较好的特异性 。结论 　多种肿瘤标志物蛋白芯片联合检测对大肠癌诊断具有辅助价 值 ,其中 C EA 、CA1929 、CA242 和 CA125 的诊断价值较高 。　　【关键词】　大肠癌 　　肿瘤标志物 　　蛋白芯片 　　诊断    Combined detection of multiple tumor marker and its diagnostic value in colorectal cancer 　M ou J i an g2 hon g ,  L i  Zen g pe n g ,   W a n g   D on g ,   M a  Y u ,   X i ao   H ual i a n g ,   Z ha n g  Q i n hon g .    De p a rt me nt  o f Pat hol o g y ,  D a p i n g  H os p i t al ,  T hi r d M i l i t a r y  M e d i cal U ni ve rs i t y ,  Cho ngqing 400042 , China　　【Abstract】　Objective 　To eval uate t he diagno stic val ues of co mbined detectio n of multiple t umo rmar ker p ro tein  using  p ro tein  chip  in  colo rectal  cancer .   Methods 　The  ser um  co ncent ratio ns of  12t umo r mar ker s  ( CA1929 ,  N S E ,  C EA ,  CA242 ,  CA125 ,  CA1523 ,  A F P , f er ritin , f2PSA ,  PSA , β2HC G a nd  H GH)  in 139 patient s wit h colo rectal cancer and 63 patient s wit h benign colo rectal le sio ns wa s deter mined a nd a nalyzed by C212 multi2t umo r ma r ker s p ro t ei n chip diagno si s system , and it s diag2 no stic val ues were eval uated.   Results 　In  single t umo r  ma r ker  detectio n , t he po sitive  rate of  C EA , CA1929 , CA242 a nd CA125  wa s 48 . 20 % , 32 . 37 % , 28 . 06 % a nd 28 . 06 % in t he colo rectal ca ncer gro up , re spectively , w hich wa s significa ntly higher t ha n in t he co nt rol gro up .  Co mbined mea surement of t he multiple mar ker s had higher sensitivit y a nd bet ter sp ecificit y.  Conclusions 　Co mbined mea sure2 ment of  multiple t umo r mar ker s by C212 p ro tein chip diagno si s system i s helpf ul fo r t he diagno si s of colo rectal ca ncer , and t he det ectio n of C EA , CA1929 , CA242 a nd CA125 ha s bet ter val ue in t he diag2no si s of colo rectal ca ncer .　　【Key words】　colo rectal ca ncer 　　t umo r mar ker 　　p ro tein chip 　　diagno si s　　大肠癌是我国最常见的恶性肿瘤之一 ,并且发病率有逐年上升的趋势 。大肠癌的早期诊断 、 疗效的监控及复发的早期检测是其有效治疗的关键 ,这有赖于大肠癌相关肿瘤标记物的准确检测 。 但是 ,目前人们还不能通过一种蛋白检测准确诊 断肿瘤。蛋白质芯片技术为检测肿瘤蛋白标志物 提供了一个大规模、高通量的快速实验工具[ 1 ]   ,对某些疾病的早期诊断具有一定价值[ 2 ]  。我们采用C212 多种肿瘤标志物蛋白芯片检测系统联合测 定大肠癌患者血清中 12 种肿瘤标志物的变化情 况 ,并分析其在大肠癌诊断中的实用价值 。1 　材料与方法1 . 1 　研究对象采用我院 2003 年 12 月 5 日 - 2005 年 3 月 13 日经病理证 实为大肠癌的患者 139 例为连续实验样本 ,63 例经证实 为大肠良性病变 ( 息肉 、腺瘤和慢性炎) 的患者作为对照样本 。大肠癌组男 83 例 ,女 56 例 。年龄 23～87 岁 ,平均年龄 54 岁 ,中位年龄 51 岁 。患者均术前采血 。对照组男38 例 ,女 25 例。年龄 38～78 岁 ,平均年龄 52 岁 ,中位年 龄 50 岁 。1 . 2 　仪器和试剂盒　　试剂盒为浙江湖州数康生物科技有限公司生产的 C212 型肿瘤诊断用蛋白芯片试剂盒 , 并采用其提供的 HD22001A生物芯片检测仪分析结果 。1 . 3 　检测对象　　12 种肿瘤标志物分别为 :甲胎蛋白 ( A F P) 、癌胚抗原 ( C EA ) 、神 经 原 特 异 性 烯 醇 化 酶 ( N S E ) 、糖 原 125 ( CA125) 、糖原 1523 ( CA1523 ) 、糖原 242 ( CA242 ) 、糖原1929 ( CA1929) 、前列腺特异性抗原 ( PSA ) 、游离前列腺特 异性抗原 (f2PSA) 、铁蛋白 (f er ritin) 、β2人绒毛膜促性腺激 素 (β2HC G) 和人生长激素 ( H GH) 。1 . 4 　标本采集　　清晨抽取空腹不抗凝静脉血 2 ml ,常规分离血清 ,置4  ℃待用 。1 . 5 　多种肿瘤标志物的检测　　将待测血清与不同浓度的标准混合液各 100 μl 加入 不同的芯片分格内 ,于 37 . 0  ℃温育振荡 30 min ,弃去孔 内液体 。吸取 200 μl 洗涤液 ,振荡洗涤 5 min ,弃去洗涤 液 ,重复洗涤 2 次 。每个芯片格内加入 100 μl 反应液 ,于37 . 0  ℃温育振荡 30 min ,弃去液体 ,重复洗涤 2 次 ,剥离 蛋白芯片集成块的上部 ,在每个芯片的膜表面加入 20 μl等体积混合 15 min 的检测液 A 和 B 混合液 ,静置 2 min ,重复洗涤 2 次 ,用 HD22001A 生物芯片检测仪测定并读 取数据 。1 . 6 　检测指标正常参考范围及结果判定　　正常参考范围 : CA125 < 35  U/ ml , CA1929 < 35  U/ ml ,CA1523 < 35  U/ ml , CA242 < 20  U/ ml , C EA < 5  ng/ ml ,A F P < 20  ng/ ml , N S E < 13  ng/ ml , PSA < 5  ng/ ml ,f2PSA < 1  ng/ ml ,β2 HC G < 3 ng/ ml , H GH < 7 . 5  ng/ ml ,F ER < 322 ng/ ml (男) 或 < 219 ng/ ml (女) 。结果判断 : 检 测值超过临界值即认为阳性 ( Fer ritin 单独升高不计入阳 性) 。1 . 7 统计学方法　　使用 SPSS10 . 0 统计软件进行统计分析 ,计数资料采 用χ2  检验 ,  P < 0 . 05 表示差异显著 ,  P < 0 . 01 表示差异 非常显著 。2 　结果2 . 1 　大肠癌与良性病变组多种肿瘤标志物阳性 率的比较从表 1 可见 ,在检测的 12 种肿瘤标记物中 ,大肠癌组C EA 、CA1929 、CA242 和 CA125 阳性率相对较高 ,非常显 著地高于良性病变组的阳性率 (χ2  = 28 . 10 、13 . 90 、12 . 19 、9 . 15 ,  P 值均 < 0 . 01) 。CA1523 、A F P 和 Fer ritin 的敏感 性较低 ;其它 5 项指标虽然特异性高 ,但是大肠癌组阳性率与良性组比较没有统计学差异 ,敏感性普遍太低 。2 . 2 　多种肿瘤标志物联合检测　　以任一项指标阳性作为结果判定标准 , 联合检测的 敏感性和特异性分别为 79 . 86 %和 49 . 21 % ; 以任二项指 标判断为 55 . 40 %和 93 . 65 % ; 若以任三项指标判定则敏 感性为 37 . 41 % ,而良性病变组没有阳性病例 ,特异性为100 % 。采用 3 种标准判定的大肠癌组阳性率均显著高 于良性组 (χ2  = 17 . 71 、42 . 42 、29 . 81 ,  P 值均 < 0 . 01) 。2 . 3 　阳性预测值与阴性预测值　　分别以任一项 、二项 、三项指标阳性进行结果判定 时 ,阳性预测值为 77 . 62 % 、95 . 06 % 、100 % ,阴性预测值 为 52 . 54 % 、48 . 76 % 、42 . 00 % 。3 　讨论　　大肠癌的早期诊断、早期治疗和病情监控是 提高疗效的最有效手段之一。目前已有多种肿瘤 相关标志物在临床诊断中得到广泛应用。但是同 一种肿瘤可能产生多种肿瘤标记物 ,单一指标检 测似乎始终存在特异性不强、阳性率较低等不足 , 合理地选择多种肿瘤标记物进行联合检测可以提 高诊断的准确性[ 3 ]  。　　蛋白芯片是生物芯片技术的一种 ,其利用抗 原和相应抗体特异性结合的双抗体夹心法的原则 ,在固相载体上点布高密度不同种类的抗体 ,捕获待测样本中的抗原 ,然后再与标记了示踪标记 物的第二抗体结合 ,并通过催化化学反应发光 ,最 后在扫描仪上读出荧光强弱 ,计算机计算结果[ 4 ]  。 该方法具有高通量 、快速和所需样本少等优点 。研究表明 ,该技术可以检测肿瘤蛋白质水平的变 化 ,比 m RN A 水平检测更能直接反映肿瘤的特性[ 5 ]  。　　本实验运用 C212 多种肿瘤标志物蛋白芯片 检测技术 ,定量分析被检者血清中的 12 种肿瘤标 志物的含量 , 结果显示 C EA 、CA1929 、CA242 和 CA125 在大肠癌组阳性率显著高于良性病变组 , 对大肠癌的诊断敏感性最高 ,而且特异性均较好 。 其中 C EA 一般被看作是消化道肿瘤 , 特别是大 肠癌的标志物 ,在大肠癌组织中的表达达到 90 % 左右 ,我们的研究显示 48 . 20 %的大肠癌患者血 清中 C EA 阳性。CA1929 、CA242 和 CA125 都是 大肠癌相关蛋白 ,在大肠癌的诊断中具有较高的 敏感性[ 6 ,7 ]   , 这与我们的实验结果一致 。N S E 、 f2P SA 、PSA 、β2H C G 及 H GH 虽然特异性高 , 但 是敏感性普遍太低 ; CA1523 、A F P 和 Fe r riti n 的 敏感性也较低 ,这 8 项指标大肠癌组阳性率与良 性病变组没有统计学差异 ,因此都基本没有诊断 价值。　　肿瘤的发生、发展是一个复杂的多机制的过 程 ,不同的大肠癌可能具有不同的肿瘤标记物表 达水平。单一肿瘤标记物检测敏感性不高 ( 如我 们实验中最高的 CEA 阳性率也只达到 48. 20 %) , 可能出现漏诊。我们联合检测 12 种肿瘤标记物 , 并以任一项、二项、三项指标阳性作为结果判定标 准 ,其敏感性和特异性分别为 79. 86 %和 49. 21 %、55 . 40 %和 93 . 65 % 、37 . 41 %和 100 % 。可见采用 不同的结果判定标准 ,联合检测既可以提高诊断 敏感性 ,又可以获得较好的特异性。因此在具体 应用时我们要针对不同的人群采用不同的标准 ,即对于临床怀疑的大肠癌患者如果任一项指标阳 性就应高度重视 ,建议进一步活检明确诊断 ;而对 于临床怀疑良性的患者或体检普查的人群 ,宜采 用更严格的 2 项甚至多项指标阳性的判定标准 , 以避免误诊 ,同时对于任一项指标阳性者也不能轻易放过 ,必须密切观察随访。　　我们的实验还显示 ,分别以任一项、二项、三 项指标阳性作为判定标准时 ,联合检测的阳性预测值均高于阴性预测值 ,很显然 ,联合检测对于阳性诊断正确的可能性高于阴性诊断 。因此对于阴 性检测结果的病人 ,尤其是临床高度怀疑的大肠 癌病人 ,我们决不能轻易地下阴性结论 ,应重新检 测并随访。　　综上所述 ,C212 多种肿瘤标记物蛋白芯片联 合检测既可以提高大肠癌诊断的敏感性 ,采用不 同的结果判定标准也可以获得较好的特异性 ,同 时具有经济 、方便、快速的临床应用性 ,是一种较 好的大肠癌辅助诊断手段。同时 ,我们还可以剔除对大肠癌诊断意义不大的肿瘤标记物 ,增加一 些新 的 大 肠 癌 相 关 肿 瘤 标 记 物 , 如 1721A 、 M U C1 、H ER2 和 MA GE 等[ 8 ]   , 进一步增加诊断 的准确性。参考文献[ 1 ]  Paweletzcp  CP ,  Cille spie J W , O r nstein D K , et  al .Rapid p ro tein di splay p rofiling of  ca ncer p ro gre ssio n directly f ro m  huma n  ti ssue  using  a  p ro tein  biochip [J ] .  Deve Re s ,2000 ,49 (1) :34 - 37[ 2 ]  Weinber ger  SR ,  Dal ma sso  EA ,  Fung  E T.   Cur rent achievement s  using  p ro tein  chip .   A r ray  technolo gy [J ] .  Cur r Opin Chem Biol ,2002 ,6 (1) :86 - 91[ 3 ] Schneider J , Pelt ri G , Bit terlich N , et al .  Fuzzy lo gic ba sed t umo r  mar ker p rofile s incl uding a  new  ma r ker t umo r M22P K imp ro ved sensitivit y to t he detectio n of p ro gressio n in  l ung  ca ncer  p atient s [ J ] .   A ntica ncer Re s ,2003 ,23 (2A) :899 - 906[ 4 ] Zhu  H , Snyder M .  Pro tei n chip technolo gy[J ] .  Cur rOpin Chem Biol ,2003 ,7 (1) :55 - 63[ 5 ] vo n Eggeling  F , J  unker  K ,  Fiedle  W , et  al .  Ma ss spect ro met r y meet s chip technolo gy : a new p ro t eo mic tool in ca ncer  re search [ J ] ? 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