p53抑制剂对热化疗损伤结肠上皮细胞p53、 Bax和MDM2表达的影响

p53抑制剂对热化疗损伤结肠上皮细胞p53、 Bax和MDM2表达的影响作者：张安平 刘宝华 张连阳 童卫东 何渝军 付涛    作者单位：400042 重庆，第三军医大学大坪医院野战外科研究所普通外科    【摘要】  目的 探讨p53抑制剂PFTα(pifithrin alpha，PFTα)对热化疗诱导原代培养结肠上皮细胞凋亡及p53靶基因Bax和MDM2表达的影响。方法 原代培养结肠上皮细胞分为正常对照组、热化疗组和PFTα加热化疗组，运用顺铂联合温热(43 ℃)处理结肠上皮细胞30 min，对比加入不同浓度的PFTα后，Annexin VFITC/PI染色，流式细胞仪检测细胞凋亡。MTT法分析PFTα对热化疗杀伤DLD1细胞的影响。Western blot检测结肠上皮细胞的p53、Bax和MDM2蛋白表达。结果 热化疗导致结肠上皮细胞发生凋亡，Bax和MDM2蛋白表达明显高于对照组。PFTα作用于顺铂联合温热处理结肠上皮细胞后，细胞凋亡率下降呈剂量依赖性，同时p53在结肠上皮细胞胞核/胞质表达比例下降，Bax和MDM2的表达逐渐降低。热化疗杀伤肿瘤细胞的效应并未受到低剂量PFTα影响。结论 PFTα对热化疗损伤结肠上皮细胞具有保护作用，其机制可能与改变p53核转位和抑制促凋亡基因Bax和MDM2的表达相关，抑制p53可作为克服热化疗抗肿瘤治疗副效应的新策略。    【关键词】  基因表达 p53抑制剂 热化疗 结肠肿瘤     p53 specific inhibitor, pifithrin α, influencing expressions of p53, Bax and MDM2 in colonic epithelial cells injured by hyperthermic chemotherapy  ZHANG Anping, LIU Baohua, ZHANG Lianyang, TONG Weidong, HE Yujun, FU Tao. Department of General Surgery, Research Institute of Surgery, Daping Hospital, Third Military Medical University, Chongqing 400042, China    【Abstract】  Objective  To investigate the effect of a p53 specific inhibitor, pifithrin alpha (PFTα), on apoptosis of colonic epithelial cells and expressions of p53 target genes Bax and MDM2 in colonic epithelial cells injured by hyperthermic chemotherapy. Methods  The primarily cultured colonic epithelial cells were divided into control group, hyperthermic chemotherapy group (HTC group) and PFTα plus hyperthermic chemotherapy group (PFTα plus HTC group). After the colonic epithelial cells were treated with hyperthermia at 43 ℃ and cisplatin at 10 mg/L for 30 minutes and added with PFTα at different concentrations, apoptosis rate was detected by using flow cytometry with Annexin VFITC and PI double labeling method. The influence of PFTα on antitumor potency of hyperthermic chemotherapy was analyzed with using methabenzthiazuron (MTT) assay. The expressions of p53, Bax and MDM2 were measured by Western blot. Results  FCM analysis showed that hyperthermic chemotherapy induced apoptosis of colonic epithelial cells, with higher protein expressions of Bax and MDM2 compared with control group. The apoptosis rate was reduced in a dosedependent manner after colonic epithelial cells were exposed to PFTα. Western blot analysis revealed that PFTα decreased the nucleartocytoplasmic p53 ratio, with gradual decrease of expressions of Bax and MDM2. At lower dosages, PFTα did not interfere with the antitumor potency of hyperthermic chemotherapy. Conclusions  PFTα protects colonic epithelial cells injured by hyperthermic chemotherapy, which suggests that PFTα may change p53 nuclear translocation and downregulate expressions of proapoptotic Bax and MDM2. Inhibition of p53 can be a new measure for overcoming side effect of hyperthermic chemotherapy for antineoplaston.    【Key words】  Gene expression; p53 specific inhibitor;  Hyperthermic chemotherapy; Colon tumor     胃肠道肿瘤术后常因腹腔内残留游离癌细胞或残余微小癌灶导致复发，温热化疗可有效杀灭游离癌细胞或残余微小癌灶，预防复发和提高术后生存率。但是温热化疗在杀伤肿瘤细胞的同时对增生活跃的肠上皮细胞产生损伤，导致如恶心、呕吐和腹泻等抗肿瘤副效应。这种副效应常因p53激活诱导肠上皮细胞凋亡引起［1-2］。p53特异性抑制剂PFTα可以阻断阿霉素、紫杉醇、γ射线等诱导的p53激活，降低正常组织的凋亡［3-4］。我们探讨通过PFTα暂时抑制p53，观察其对顺铂联合温热损伤肠上皮细胞的p53及其靶基因Bax和MDM2蛋白表达的影响。1  材料与方法    1.1  材料    参照文献［5］进行结肠上皮细胞体外培养。PFTα为Calbiochem公司产品，顺铂、二甲基亚砜(Dimethyl sulfoxide，DMSO)和碘化丙啶(Propidiumiodide，PI)为Sigma公司产品，Western Blot发光试剂盒、p53单抗、Bax和MDM2单抗均购自Santa Cruz公司，Annexin VFITC购自BD公司， DMEM培养液、 RPMI1640培养液、 胎牛血清购自Hyclone公司， 其他试剂和药品为国产或进口分装。    张安平，等. p53抑制剂对热化疗损伤结肠上皮细胞p53、Bax和MDM2表达的影响及意义  1.2  MTT分析    对数生长期的大肠癌细胞系DLD1细胞以4×103个/孔接种于96孔培养板培养用RPMI1640培养液24 h后，吸除培养液后加入含0.4%血清的RPMI1640同步化细胞48 h，分别加入含PFTα 5、10、20、30、40、50、60 μmol/L的RPMI1640培养液180 ml孵育4 h后进行热化疗处理，在热化疗处理完毕后用PBS洗细胞两次，再重新加入上述PFTα后将细胞放入孵箱培养。另一组只加入上述不同剂量PFTα而不进行热化疗处理。每组6个复孔培养24 h后，每孔加MTT溶液(5 g/L)20 ml继续培养4 h终止培养，小心吸弃孔内培养上清液，每孔加入DMSO 150 ml振荡10 min使结晶充分溶解，用酶标仪在570 nm波长处测定各孔的吸光度值。    1.3  分组及处理    将对数生长期结肠上皮细胞，用0.25%胰蛋白酶消化后，每孔5×104个细胞接种于6孔培养板培养24 h后，将培养细胞分为3组：(1)正常对照组(control group，CON)；(2)热化疗组(hyperthermic chemotherapy group，HTC)：顺铂溶于DMSO中，终浓度为10 mg/L加入培养板中，在43 ℃恒温水浴箱中处理30 min后，用PBS洗细胞两次，加入培养基将细胞放入孵箱培养2 h；(3)PFTα+热化疗组(PFTα＋HTC)： PFTα在临用前溶解于DMSO，在热化学处理前4 h以10、20、30、40 μmol/L加入培养板中，然后处理同热化疗组，在热化疗处理完毕后用PBS洗细胞两次，再重新加入上述PFTα后将细胞放入孵箱培养2 h。    1.4  细胞凋亡检测    收集各组细胞，2 000 r/min，4 ℃离心5 min后，冷PBS重悬，离心，弃上清再次重悬离心，加Annexin VFITC溶液5 μl和PI溶液2.5 μl到100 μl细胞悬浮液中，混匀后避光反应10 min，加150 μl样品稀释液到样品中，混匀后上机检测。    1.5  Wesrtern blot检测    提取结肠上皮细胞胞质、胞核总蛋白，Bradford法测定蛋白浓度后上样，10% SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳后行半干转膜至PVDF膜上，封闭液封闭后依次加入p53单抗、Bax和MDM2单抗(一抗1∶200)和辣根过氧化物酶标记的IgG(二抗1∶2 500)室温孵育，再加入化学发光试剂与PVDF膜共孵育后进行自显影。用扫描分析软件 (Labwork 4.0)测量Western blot积分光密度值(IOD)，以正常对照组实际IOD值为参照，其他组别的IOD与之相比的相对积分光密度为蛋白的表达量。    1.6  统计学处理    各组数据均以±s表示。以SPSS 11.5版统计分析软件对各组数据进行t检验和单因素方差分析。2  结果    2.1  PFTα对热化疗抗肿瘤细胞能力的影响    DLD1细胞在无热化疗作用下，PFTα达50 μmol/L时，PFTα对DLD1细胞生长具有一定的抑制效应，当达60 μmol/L，抑制效应更趋明显(P<0.01)。PFTα自身表现出对DLD1细胞的毒副效应。PFTα联合热化疗处理DLD1细胞时，当PFTα低于40 μmol/L，对热化疗杀伤DLD1细胞无增强或减弱效应，当达50和60 μmol/L，PFTα显著增强热化疗对DLD1细胞的杀伤效应，表现出细胞毒副作用的叠加效应(图1)。    2.2  PFTα对热化疗诱导结肠上皮细胞凋亡的影响    肠上皮细胞自然凋亡率在(2.88±0.44)%，热化疗损伤后其凋亡率达(27.03±2.07)%，PFTα呈剂量依赖性抑制热化疗诱导的肠上皮细胞凋亡，凋亡率由(14.83±1.51)%逐渐下降至(3.75±0.33)%，与热化疗组相比凋亡率显著下降(P<0.01)(表1)。表1  各组结肠上皮细胞凋亡率变化    2.3  PFTα对结肠上皮细胞胞核和胞质p53表达的影响    Western blot分析显示热化疗损伤后p53主要在细胞核表达，胞核/胞质比值为13.22。10 μmol/L PFTα作用后胞质表达升高，胞核表达减少，胞核/胞质比值下降至0.80，40 μmol/L PFTα作用后这种变化更显著。与热化疗组相比p53胞核/胞质表达比差异有统计学意义(P<0.01)(表2)。表2  p53在结肠上皮细胞胞核和胞质表达变化    2.4  PFTα对结肠上皮细胞Bax和MDM2蛋白表达的影响    结肠上皮细胞在受到热化疗损伤后Bax和MDM2表达显著增强，运用PFTα后Bax和MDM2表达逐渐降低，在PFTα为10 μmol/L时即可观察到这种抑制效应，并呈现剂量依赖性抑制(P<0.01)(表3)。表3  结肠上皮细胞Bax、MDM2蛋白表达3  讨论    目前研究发现在人类大部分肿瘤中存在p53的缺失或变异。p53的缺失可导致基因不稳定、肿瘤转化加快以及抗肿瘤治疗产生耐受等。通常认为p53的失活可能是有害的，故在抗肿瘤治疗中更多的是如何恢复p53的功能。但是，p53不仅限于杀伤肿瘤细胞，许多正常组织如淋巴结、造血器官、肠上皮细胞和睾丸组织等也存在p53表达，抗肿瘤治疗对这些组织或器官同样造成一定程度损害。有研究报道肿瘤的化疗、放疗和腹腔温热灌注化疗常导致严重的副效应而降低其抗肿瘤治疗效应。这种副效应由p53介导的凋亡所引起［6-8］。在治疗p53缺失的肿瘤中，暂时性抑制p53可以作为减轻对正常组织损害的治疗策略［3-4］。    p53特异性抑制剂PFTα是一种小分子化学合成物，可使经γ射线致死剂量照射C57BL和Balb/c两系小鼠的存活达60%，在照射后7个月并无新发肿瘤，认为PFTα通过抑制p53的激活能够抑制抗肿瘤治疗的副效应［9］。腹腔内温热灌注化疗是腹腔肿瘤播散有效的治疗措施，但同时对于增生活跃的正常组织如肠上皮细胞、毛囊细胞和造血干细胞等也产生损伤。顺铂作为常用的抗肿瘤药物，可以与DNA结合形成交链，抑制DNA合成而导致细胞周期停滞和凋亡发生，而温热可增加细胞对顺铂的摄取，增强顺铂的抗肿瘤效应［10-12］。国外研究者［13］发现顺铂常引起耳蜗和前庭感觉毛细胞的损害而导致不可逆转的听力丧失和平衡障碍，对新生小鼠的前庭和耳蜗进行器官培养，在顺铂处理的耳蜗和前庭中加入PFTα，可以使毛细胞的生存率增加且呈剂量依赖性。通过抑制p53的表达，使顺铂诱导耳蜗和前庭毛细胞的Caspase1、Caspase3活性降低，明显降低对毛细胞的损害，为减轻顺铂引起的耳毒性、前庭毒性和神经毒性副作用提供新的方法。    本研究采用原代结肠上皮细胞为研究对象，顺铂联合温热处理可导致结肠上皮细胞发生凋亡，p53蛋白向细胞核内聚集，Bax和MDM2的表达显著升高。通过运用PFTα阻断p53由细胞质向胞核转运，降低Bax和MDM2的表达，而使MDM2与p53结合减少，并抑制Bax启动子上的p53反应元件，发挥保护结肠上皮细胞的功能，提高细胞的生存率。研究显示PFTα浓度在5～40 μmol/L之间时对于大肠癌细胞系DLD1细胞的增殖无抑制效应，也不增强热化疗对肿瘤细胞的杀伤效应。而当浓度在50 μmol/L以上，研究显示PFTα抑制肿瘤细胞的增殖，自身表现出明显的细胞毒作用，同时与热化疗杀伤肿瘤细胞产生协同效应。因此，认为在实验中PFTα的浓度应低于40 μmol/L，则PFTα自身无论对结肠上皮细胞还是对肿瘤细胞的增殖均无影响，国外研究者也有类似报道［14-15］。有研究显示PFTα对阿霉素诱导心肌细胞凋亡和心功能损害有保护效应。阿霉素上调Bax和MDM2 mRNA水平，通过p53在丝氨酸15的磷酸化水平提高上调p53蛋白水平，诱导心肌细胞凋亡导致阿霉素的心脏毒性、超微结构改变和心功能障碍。在给予阿霉素前30 min和给药后3 h使用PFTα，心肌细胞Bax和MDM2 mRNA水平下降，实验表明PFTα可有效抑制阿霉素诱导的心肌细胞凋亡，减轻阿霉素抗肿瘤治疗中对心脏的损伤［15］。本研究认为PFTα抑制热化疗诱导结肠上皮细胞凋亡，降低对细胞的损伤，为以后通过抑制p53而减轻抗肿瘤副效应提供了新的思路，但PFTα发挥保护作用的机制有待深入研究。【参考文献】［1］ van der Vange N, van Goethem A R, Zoetmulder F A, et al. 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