游离亚油酸对胰腺腺泡细胞的影响及其机制的探讨

游离亚油酸对胰腺腺泡细胞的影响及其机制的探讨作者：王亚军 孙家邦 李非 孙海晨　    作者单位：100053 北京，首都医科大学宣武医院普外科    【摘要】  目的 探讨游离亚油酸对胰腺腺泡细胞的影响及其可能的机制。方法 分离胰腺腺泡细胞，分别与0.1、0.5、1.0 mmol/L亚油酸共同孵育30、60、90 min，测定细胞的LDH释放率，DNA片段梯度分析腺泡细胞凋亡，流式细胞仪测定细胞凋亡率，Western blot检测腺泡细胞PKC的膜转位，激光共聚焦测定细胞内钙的变化。结果 腺泡细胞与亚油酸共同孵育后，台盼蓝染色显示存在细胞损伤，LDH释放率与亚油酸呈时间和剂量依赖关系。细胞总DNA凝胶电泳结果显示1.0 mmol/L亚油酸可出现DNA梯状条带，证明存在细胞凋亡。同时，腺泡细胞凋亡率及PKC的膜转位率，均与亚油酸呈剂量和时间依赖关系。另外，钙离子是参与细胞损伤和PKC激活的因子之一，采用激光共聚焦方法检测腺泡细胞内钙浓度，发现其升高与亚油酸呈浓度依赖性。结论 亚油酸对胰腺腺泡细胞损伤存在剂量和时间依赖关系。游离亚油酸刺激腺泡细胞内钙升高和活化PKC诱导细胞凋亡可能是高脂血症性胰腺炎的发病机制之一。     【关键词】  胰腺腺泡细胞 游离亚油酸 细胞凋亡 蛋白激酶C 细胞内钙离子     Exploration on free fatty acid affecting pancreatic acinar cell and its possible mechanism  WANG Yajun, SUN Jiabang, LI Fei, SUN Haichen. Department of General Surgery, Xuanwu Hospital of Capital University of Medical Science, Beijing 100053, China    【Abstract】  Objective  To investigate the effects of free fatty acid on pancreatic acinar cell and explore possible mechanism. Methods  Pancreatic acinar cells from adult rats were incubated with linoleic acid at concentrations of 0.1 mmol/L, 0.5 mmol/L and 1.0 mmol/L for 30, 60 and 90 minutes respectively to measure the LDH release rate of acinar cells. DNA ladder analysis was used to analyze apoptosis of acinar cells, flow cytometry to determine apoptosis rate, Western blot to detect PKC membrane translocation and laser scanning confocal microscopy (LSCM) to observe intracellular calcium changes. Results  After incubation with linoleic acid, pancreatic acinar cells stained with trypan blue were damaged, with LDH release rate at time and dosedependent fashion with linoleic acid. DNA ladder was formed by agarose gel electrophoresis when acinar cells were incubated with 1.0 mmol/L linoleic acid, as proved apoptosis of acinar cells. Also, acinar cell apoptosis rate and PKC membrane translocation level were related with linoleic acid at a time and dosedependent fashion. In addition, intracellular calcium was one of the factors leading to cell injury and PKC activation. LSCM showed that the rising of intracellular calcium existed at a dosedependent fashion with linoleic acid. Conclusions  Linoleic acid damaging acinar cell is dependently related to dose and time. Free fatty acid stimulating increase of intracellular calcium and activation of PKC inducing apoptosis is one of pathogenetic mechanisms of hyperlipaemic pancreatitis.    【Key words】  Pancreatic acinar cells; Free fatty scid; Cell apoptosis; Protein Kinase C; Intracellular calcium    高脂血症是继胆石和酒精之后急性胰腺炎(acute pancreatitis，AP)的又一常见病因。目前还没有可以用来研究高脂血症诱导AP理想的动物模型， 高脂血症引起AP的机制仍不清楚。高脂血症的胰腺毒性主要源于甘油三酯(Triglyceride,TG)分解产物游离脂肪酸(Free fatty acid, FFA)的毒性。近年来，已有FFA通过激活细胞内蛋白激酶C(Protein kinase C,PKC)调控胰岛素的分泌或诱导胰腺内分泌细胞凋亡造成2型糖尿病的报道［1］。亚油酸是TG中常见不饱和FFA，因此，探讨亚油酸对胰腺腺泡细胞损伤的可能机制，对AP的诊治有着重要的意义。1  材料与方法    1.1  动物及主要试剂    雄性SD大鼠(200～250 g)购自军事医学科学院实验动物中心；大豆蛋白酶抑制剂、胶原酶Ⅺ、透明质酸酶Ⅱ、亚油酸、PKC抗体等均为美国Sigma公司产品；Fluo3/AM购自美国BioRad公司。    1.2  方法与步骤    1.2.1  胰腺腺泡细胞的分离和分组    参照文献［2］方法并改良。麻醉SD大鼠，切取胰腺，胰腺间质内多点注射消化液(含胶原酶和透明质酸酶)，37 ℃振荡水浴温孵10 min，更换消化液，剪碎组织并轻轻吹打孵育7～10 min，经0.074 mm筛孔铜网过滤，50×g离心3 min，去除上清液，Hanks平衡盐溶液(含0.25% BSA和0.01%大豆胰蛋白酶抑制因子)洗涤2次，悬于RPMI1640细胞培养液中，进行计数和台盼蓝排斥实验。将细胞转入24孔培养板，培养液2 ml，加入不同量的亚油酸，使其浓度为0.1、0.5、1.0 mmol/L，分别孵育30、60、90 min，检测腺泡细胞的损伤。    1.2.2  乳酸脱氢酶(LDH)的释放率    采用常规生化比色法分别测定上清液和细胞裂解液中LDH含量。亚油酸与腺泡细胞孵育后，收集培养上清液，细胞用裂解液(150 mmol/L NaCl，150 mmol/L Tris/HCl，1 mmol/L EDTA，1% Triton X100)裂解，收集裂解液。按公式计算LDH释放率：    王亚军，等. 游离亚油酸对胰腺腺泡细胞的影响及其机制的探讨      释放率(%)=上清液LDH细胞裂解液LDH+上清液LDH×100%    1.2.3  DNA片段梯度分析    取腺泡细胞，加入细胞裂解液，37 ℃温育过夜，加入5 mol/L NaCl充分混合，5 000 r/min，4 ℃离心30 min，取上清加入2倍体积的无水乙醇，充分混匀，-20 ℃放置过夜，4 ℃ 12 000 r/min离心20 min，收集沉淀，用75%乙醇洗涤2次，自然风干。TE液溶解沉淀，加入RNA酶，37 ℃水浴1 h。取样品2%琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察拍照。    1.2.4  PI流式细胞术检测凋亡    收集1×106新鲜细胞，加入PBS液，注入70％冷乙醇，1 500 r/min离心5 min，弃乙醇，再用PBS洗2次。加入RNase A，孵育30 min后，加入0.5 ml PI液DNA染色，置冰上30 min。用0.074 mm筛孔尼龙网过滤，流式细胞仪检测。    1.2.5  激光共聚焦显微镜检测腺泡细胞内Ca2＋离子    提取腺泡细胞，置入底部自制方形小仓的培养皿，加入Fluo3/AM，标记40 min。轻洗培养皿2次，加培养基进行共聚焦扫描。扫描过程中待曲线稳定后加入亚油酸，使其浓度分别为1.0、0.5、0.1 mmol/L。扫描所得荧光图像，经计算机处理，得到细胞内钙离子变化的时间效应曲线。    1.2.6  细胞膜蛋白和胞质蛋白样品的制备    收集细胞，加入100 μl冰匀浆液(含Tris/HCl 50 mmol/L，pH 7.4；NaCl 150 mmol/L；EDTA 2 mmol/L；EGTA 2 mmol/L；DTT 2 mmol/L；Na pyrophosphate 5 mmol/L；KF 50 mmol/L；PMSF 1 mmol/L；Aprotinin、Leupeptin、Pepstatin A 1 μg/ml)，匀浆。4 ℃，10 000×g离心1 h，上清液为胞质蛋白成分，保存；沉淀再用100 μl胞膜蛋白提取液(上述匀浆液＋1% NP40＋1 mmol/L Na3VO4)，10 000×g继续离心1 h，取上清液作为膜相关蛋白成分。然后用Lowry's法进行蛋白定量。    1.2.7  Western Blot法检测细胞PKC的膜转位    从上述制备的每个样品中取出20 μg蛋白，用10% SDS2PAGE，在4 ℃、20 mA的条件电泳115～210 min。电泳完成后，在4 ℃、400 mA、2 h的条件下，将蛋白从SDS2PAGE上转移到硝酸纤维素(NC)膜上，进行PKC的蛋白印迹实验。首先用PBST漂洗NC膜，再置于5%脱脂奶粉封闭液中，4 ℃过夜。漂洗3次，在室温下将NC膜与PKC山羊抗体(1∶2000)温浴2 h。漂洗，再与碱性磷酸酶标记的抗羊的二抗(1∶1 000)温浴1 h。最后，漂洗NC膜，与ECL溶液反应约5 min后，进行X光胶片显影，应用Bandscan 4.30分析软件进行半定量分析。    1.3  统计学方法    实验结果数据以±s表示，采用多因素方差分析，在SPSS 11.0统计软件上进行，P<0.05表示差异有统计学意义。2  结果    2.1  分离腺泡细胞台盼蓝染色    腺泡细胞呈圆形，散在或簇状分部，经台盼蓝排斥试验证实细胞存活在90%以上，计数在106～1010个细胞/ml。    2.2  LDH释放率    用不同浓度亚油酸作用胰腺腺泡细胞后台盼蓝染色观察，部分腺泡细胞出现蓝染，证明存在细胞损伤。LDH的释放率可以反映腺泡细胞损伤的严重程度，LDH的释放率与亚油酸剂量和作用时间呈依赖关系。见图1。    图1  亚油酸诱导腺泡细胞损伤呈时间剂量依赖效应，LDH反映细胞损伤的程度    a：P<0.001，b：P<0.05，与对照组比较    2.3  腺泡细胞DNA片段化    为了证实亚油酸对胰腺细胞的毒性，是否为通过诱导细胞凋亡而引起的，进一步行琼脂糖凝胶电泳DNA ladder的检测。DNA ladder检测结果，1.0 mmol/L亚油酸作用60 min出现清晰的DNA梯状条带，从而证明了随着亚油酸浓度的增高可以诱导细胞凋亡。见图2。    图2  亚油酸诱导胰腺腺泡细胞凋亡出现DNA梯状条带    1： 对照组； 2： FFA 0.1 mmol/L； 3： FFA 0.5 mmol/L； 4： FFA 1.0 mmol/L    2.4  亚油酸对腺泡细胞凋亡的影响    为了证实亚油酸的胰腺腺泡细胞毒性与诱导细胞凋亡的关系，用碘化丙碇对细胞DNA进行染色，流式细胞仪检测。实验结果表明腺泡细胞的凋亡率与亚油酸呈剂量和作用时间依赖关系。见图3。    图3  PI染色流式细胞仪检测亚油酸诱导的细胞凋亡    2.5  亚油酸对腺泡细胞内钙离子［Ca2+］i的影响    研究表明，细胞钙超负荷是细胞损害的一条共同途径，细胞钙超负荷与AP形态学损害有关［3］。细胞经Fluo3/AM负载，亚油酸刺激细胞，［Ca2+］i曲线上升的幅度随亚油酸的浓度增大而增大，0.1、0.5和1.0 mmol/L组［Ca2+］i平均上升(3.18±3.04)、(5.13±9.43)和(12.60±2.64)mmol/L。对照组给药前后［Ca2+］i无明显变化。见图4。    图4  亚油酸诱导腺泡细胞内钙荧光强度变化曲线    2.6  腺泡细胞PKC的膜转位    已证实FFA导致胰岛素抵抗与PKC的激活诱导B细胞凋亡密切相关，上述结果也证明FFA可以诱导腺泡细胞凋亡和细胞内钙超负载，那么，FFA是否也可能激活了腺泡细胞内PKC呢?由图5的蛋白印迹结果可见，随着亚油酸作用时间的延长和浓度的增大，腺泡细胞胞质内PKC的含量逐渐减少，而腺泡细胞膜相关成份内PKC的含量逐渐增加。计算PKC膜转位的比例(膜相成分PKC的光密度/胞质+膜相成分内PKC的光密度×100％)［4］，PKC的膜转位比例随亚油酸作用时间延长和浓度增加而增大，PKC膜转位比例与亚油酸剂量和作用时间呈依赖关系。见图6。    图5  Western blot检测亚油酸诱导腺泡细胞的PKC膜转移    图6  亚油酸诱导腺泡细胞PKC膜转位呈时间剂量依赖效应3  讨论    目前，高脂血症引起AP的机制主要集中在FFA的毒性作用。FFA的种类不同，对细胞的毒性作用也不同。不饱和FFA毒性最强，单不饱和及饱和FFA几乎无或很少有毒性。亚油酸是人体必需脂肪酸，是甘油三酯中最常见的不饱和脂肪酸，所以，研究亚油酸对胰腺细胞的损伤具有一定的代表性。本研究结果显示，用亚油酸与胰腺腺泡细胞共同孵育，台盼蓝染色细胞出现明显的损伤。LDH释放率与亚油酸分别作用胰腺腺泡细胞时间和剂量呈依赖性。研究显示，FFA可以抑制胰岛β细胞分裂、增殖，诱导β细胞的凋亡，减少胰岛素的分泌［5］。FFA同样可能诱导胰腺腺泡细胞的凋亡。亚油酸以时间剂量依赖性的诱导胰腺腺泡细胞凋亡，此结果与腺泡细胞损伤后的LDH释放率的变化基本一致。

    胰腺腺泡细胞经亚油酸刺激后，细胞内［Ca2+］i升高，证明亚油酸对腺泡细胞的损害存在剂量依赖关系。亚油酸可引起多种组织内二酰基甘油(diacylglycerd,DAG)水平升高，DAG可激活PKC，这方面在FFA产生胰岛素抵抗的研究中已有许多报道［6］。本研究结果表明，FFA剂量依赖性的导致细胞内钙的升高，也呈时间和剂量依赖性的导致腺泡细胞内PKC的活化和细胞的凋亡，可以进一步推测，FFA可能通过G蛋白途径激活了细胞内磷脂酶C(phospholipase C,PLC)，催化磷脂酰肌醇水解，产生三磷酸肌醇(trisphosphateinositol,IP3)和DAG，前者引起细胞内钙库释放［Ca2+］i入胞质，非活性态PKC与［Ca2+］i相互作用而发生膜移位，形成无活性的酶膜复合物。DAG与PKC的调节功能域C1区结合，引起调节功能域的构象变化，从而导致假底物功能域的释放，促使PKC活化，PKC的激活可以引起丝裂原激活蛋白激酶级联反应，导致腺泡细胞的凋亡。【参考文献】  ［1］ Haber E P, Ximenes H M, Procopio J, et al. Pleiotropic effects of fatty acids on pancreatic betacells［J］. J Cell Physiol,2003,194(1):1-12.  ［2］ Zhou W, Levine B A, Olson M S. Patelet activating factor: a mediator of pancreatic inflammation during cerulean hyperstimulation［J］. Am J Pathol,1993,142(5):1504-1512.  ［3］ Mayer J, Rau B, Schoenberg M H, et al. Mechanism and role of trypsinogen activation in acute pancreatitis［J］. Hepatogastroenterology,1999,46(29):2757-2763.  ［4］ 崔秀玉，李俊发，韩松，等.低氧预适应增高小鼠脑组织内cPKCγ的膜转位水平［J］.生理学报,2004,56(4):461-465.  ［5］ Rakatzi I, Mueller H, Ritzeler O, et al. Adiponectin counteracts cytokine and fatty acidinduced apoptosis in the pancreatic betacell line INS1［J］. Diabetologia,2004,47(2):249-258.  ［6］ Eitel K, Staiger H, Rieger J, et al. Protein kinase C delta activation and translocation to the nucleus are required for fatty acidinduced apoptosis of insulinsecreting cells［J］. Diabetes,2003,52(4):991-997.