高强度超声联合阿霉素治疗兔门静脉癌栓

高强度超声联合阿霉素治疗兔门静脉癌栓作者：范炜 罗世谯 李崇燕 王燕芹 胡凯 王智彪    作者单位：400014 重庆市第三人民医院肝胆外科    【摘要】  目的 探讨高强度超声 (HIU) 联合抗癌药物治疗兔门静脉癌栓的有效性和安全性。方法 45只实验兔分为4组，VX2肿瘤种植于门静脉腔内5 d，15只接受HIU治疗(HIU组)；10只接受阿霉素治疗(ADM组)；10只接受HIU+ADM联合治疗(HIU+ADM组)；10只接受假照治疗(对照组)。从HIU组中随机取5只兔于治疗后7 d测量门静脉压，处死后对其进行病理学及电镜检查，并观察记录各组兔生存时间。结果 治疗后门静脉压无明显降低(P>0.05)。靶区组织发生凝固性坏死，靶区内门静脉无破裂及出血，HIU组、HIU+ADM组较ADM组、对照组生存时间明显延长(P<0.05)；ADM组、对照组两组间生存时间比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论 HIU联合抗癌药物能够较为安全有效地治疗兔门静脉癌栓。     【关键词】  门静脉癌栓 高强度超声 阿霉素 肝肿瘤 兔    Treatment of implanted portal vein tumor thrombus with high intensity ultrasound in combination with adriamycin in rabbits  FAN Wei, LUO Shiqiao, LI Chongyan, WANG Yanqin, HU Kai, WANG Zhibiao. Department of Hepatobiliary Surgery, Third People's Hospital of Chongqing, Chongqing 400014, China    【Abstract】  Objective  To investigate the efficacy and security of high intensity ultrasound (HIU) in combination with adriamycin (ADM) in treatment of implanted portal vein tumor thrombus of rabbits. Methods  Fortyfive rabbits with implanted  portal vein tumor thrombus for five days were randomly divided into four groups, ie, Group HIU (n=15) received HIU sonication, Group ADM (n=10) received ADM, Group HIU+ADM received HIU and ADM and control group (n=10). Five rabbits out of Group HIU were randomly chosen to measure portal vein pressure (PVP) at 7th day and then sacrificed for pathological and electron microscopic observations and recording survival time of rabbit in each group. Results  After treatment with HIU, PVP showed insignificant decrease, with no statistical difference (P>0.05); target tissue had coagulative necrosis but there was no hemorrhage or vessel rupture of portal vein inside the targeted tissue. The survival time in the Group HIU and Group HIU+ADM was significantly longer than that in Group ADM and control group (P<0.05). However, there was no significant difference upon survival time between Group ADM and control group(P>0.05). Conclusions  HIU in combination with ADM is safe and effective for treating implanted portal vein tumor thrombus of rabbits.    【Key words】  Portal vein tumor thrombus;  High intensity ultrasound;   Adriamycin； Liver tumor; Rabbits    肝癌尤其是晚期肝癌患者并发门静脉癌栓的比例很高，占62.2%～90.2%。一般认为门静脉癌栓是疾病的晚期表现，预后不良。尽管外科手术历来是肝癌治疗的首选疗法，但大多数患者就诊时已属晚期，根治性手术已不可能。因此非手术治疗仍占有重要的地位，常见的方法有肝动脉栓塞、瘤内无水酒精注射、外放射及多种方法的综合运用，总体疗效有待评价。随着20世纪90年代以来高强度超声(high intensity ultrasound,HIU)技术的发展，使超声治疗肿瘤成为可能。本实验拟采用高强度超声联合阿霉素(adriamycin,ADM)对兔门静脉癌栓进行治疗研究，探讨一种新的门静脉癌栓治疗方法。1  材料与方法    1.1  实验动物    新西兰大白兔45只，3～4月龄，体重2～2.5 kg，雌雄不限，由重庆医科大学实验动物中心提供。    1.2  细胞系    VX2肿瘤细胞株，由乳头状病毒诱发的鳞状细胞癌，由日本京都Funabshi Farm公司馈赠。    1.3  实验设备    HIU治疗机由重庆医科大学医学超声工程研究所自行设计研制。它由功率发生源、循环脱气水降温系统及平面超声治疗头3部分组成。功率源为45 cm×40 cm×20 cm大小的便携式机箱,治疗头输出的声波为平面非聚焦高强度超声波，平均声强为45.86 W/cm2, 频率10 MHz，探头直径5 mm，治疗用超声声强已经检测［1］。    1.4  实验试剂    包括戍巴比妥钠或乌拉坦溶液、RPMI1640培养液、青霉素针剂等。    范炜,等. 高强度超声联合阿霉素治疗兔门静脉癌栓  1.5  实验方法    1.5.1  兔门静脉癌栓模型的建立    参照文献［2］方法。    1.5.2  实验分组与设计    本实验将45只实验兔随机分为4组：HIU组(n=15)；ADM组(n=10)；HIU+ADM组(n=10)；对照组(n=10)。HIU组接种癌组织后5 d在无菌条件下进入腹腔，钝性分离粘连，显露门静脉癌栓部位，观察肿瘤生长情况。用消毒后的平面探头置于肿瘤表面，近端手指按压阻断门脉血流后，先照射肿瘤部位，然后照射肿瘤边缘1.5 cm范围内的组织，每次照射时间为30 s，共照射5次，治毕关腹，待兔苏醒后送动物中心饲养。术后3 d每日给予青霉素20万u肌肉注射。ADM组于接种后第4、5、6天在无菌情况下经兔耳缘静脉将ADM缓慢注入，剂量为2.5 mg/kg，分3 d给予。HIU+ADM组采用HIU和ADM联合治疗。对照组于接种后5 d，用消毒后的平面探头局部假照30 s×5次。    1.5.3  门静脉压的测定    从HIU治疗组中随机取5只实验兔于治疗前及治疗后7 d测量其门静脉压。实验兔取平卧位，在无菌条件下进入腹腔，显露门静脉及肠系膜上静脉，将充满生理盐水的导管自肠系膜上静脉或其分支插入门静脉主干并妥善固定后，将导管问上牵直(与水平面垂直)，待导管内水柱自然下落至其仅随呼吸上下波动或稳定不动时，以脊柱前缘水平为测量零点，测量水柱的高度，即为此刻的自由门静脉压［3］。    1.5.4  病理学检查    HIU组测定门静脉压力后处死, 切取治疗局部靶区组织及肝脏可疑病灶送病检，10%甲醛固定，石蜡包埋，10 μm连续切片，HE染色，HE切片在Olympus多头显微镜下由有经验的病理专家指导观察读片。    1.5.5  电镜检查    同法取治疗局部靶区组织标本进行电子显微镜观察。迅速取出组织块，切成1 mm×1 mm×1 mm，立即置入4%的戊二醛中在4 ℃冰箱中固定2 h,以0.1mol/L PBS液冲洗后，1%锇酸固定2 h，乙醇与丙酮梯度脱水，618环氧树脂浸透、包埋。CQR1型超薄切片机制备半薄切片，经定位后制备超薄切片，醋酸双氧铀和硝酸铅染色，H600透射电镜观察，摄片。    1.5.6  生存时间    记录每只动物的生存时间，对死亡兔行病理检查，查出死亡原因。    1.6  统计学方法    门静脉压的比较采用t检验，实验兔生存时间分析采用方差分析。2  结果    2.1  门静脉压变化    HIU治疗前门静脉压力为(14.36±1.96)cm H2O(1 cm H2O=0.098 kPa)，治疗后门静脉压力为(14.30±1.96)cm H2O。治疗前后比较差异无统计学意义(t=1.177，P=0.305)。    2.2  病理学检查    2.2.1  接种后5 d，门静脉壁上可见大量癌组织，癌细胞呈巢状，明显异型性， 呈浸润性生长，向门静脉腔内凸起，致管腔部分狭窄。    2.2.2  治疗后光镜下可见靶区内癌栓呈凝固性坏死，癌细胞形态不完整，不规则，大部分细胞已有核固缩，亦可见细胞核碎裂溶解甚至消失，肿瘤细胞完全被破坏。    2.3  电镜检查    电镜下见靶区中央凝固性坏死区的细胞结构绝大多数被破坏，肿瘤细胞膜型细胞器肿胀、空泡化，线粒体肿胀、空泡化，嵴变短、减少，排列紊乱。内质网扩张和空泡变普遍。细胞核染色质边集(为细胞死亡过程中较早期的核病变之一)，核固缩、核碎裂，溶解亦可见。    2.4  生存时间    HIU组与HIU+ADM组实验兔的生存时间多在70 d以上，远大于对照组实验兔平均生存时间(38±5)d，4组比较见表1。实验兔自然死亡后解剖，死亡原因皆为肿瘤肝转移。表1  门静脉癌栓各治疗组之间生存时间方差分析3  讨论    20世纪80年代国际上兴起了超声治疗学技术的研究，并迅速在美国、英国、日本等国开展起来，由最初主要用于神经系统疾病治疗到现在的肿瘤治疗，经历了巨大的飞跃。超声治疗的强度也由低强度、中等强度发展到现在的高强度治疗。高强度超声的物理特性主要为热效应与空化效应。(1)热效应：HIU可在5～10 s时间内产能，使靶区内产生瞬态高温达65 ℃以上，而靶区周围组织升温不明显，这可使靶区内的组织发生热凝固坏死，并渐为纤维结缔组织吸收，又不致对靶区外的组织产生明显的影响。(2)空化效应：高强度、短时间的照射，由于空泡形成，逐渐增大，获得能量，突然破裂，此种破裂产生巨大压力，损伤临近组织［4］。由重庆医科大学医学超声工程研究所自行研制的高强度聚焦超声肿瘤治疗系统，已成功应用于临床肝癌、乳腺癌，骨肉瘤及软组织肉瘤的治疗，取得了较好的效果。但HIU治疗门静脉癌栓经笔者检索目前尚无报道。动物实验已经证明HIU能杀死肝癌细胞，对直径>0.2 mm的血管不造成损害［5］，且HIU治疗实验性肿瘤不增加转移的发生率［6］。正是由于HIU能有效地破坏不正常组织或肿瘤组织，抑制肿瘤的生长，减少肿瘤的复发，故本实验采用HIU进行兔门静脉癌栓的治疗。    我们在实验中采用的肿瘤细胞株是VX2鳞状细胞癌。文献报道［7-10］，鳞癌对阿霉素敏感。阿霉素是一种抗肿瘤“抗生素”，其作用机理主要是嵌入DNA而抑制RNA和RNA的合成，对RNA的抑制作用最强，抗瘤谱较广，对多种肿瘤及各种生长周期的肿瘤都有作用，属周期非特异性药物，具有强烈的细胞毒性作用。阿霉素与热疗合并使用对VX2细胞的毒性作用时，发现先化疗再热疗的效果比单纯化疗或热疗以及先热疗后化疗的治疗效果更佳［11］。而HIU治疗肿瘤的机制热效应是其破坏肿瘤组织的主要因素，且HIU只是一种局部治疗手段。当临床上发现门静脉癌栓后往往已有肝内的微小播散。因此，本实验采用阿霉素进行门静脉癌栓的全身化疗，并在实验中设立阿霉素药物化疗合并HIU组，与之相对应的是HIU组，阿霉素化疗组以及对照组。    我们在术中用HIU直接照射门静脉癌栓及其周围一定范围的组织，每次治疗探头重叠1/5～1/3可将肿瘤完全破坏。这可能是由于此种方式杀死了浸润到周边的恶性肿瘤细胞，使周边小的血管、淋巴管破裂塌陷，既阻断了肿瘤的血供，又可防止癌细胞扩散。实验结果表明，经HIU照射后，光镜下可见靶区内的肿瘤细胞均呈不可逆的坏死，由核固缩渐渐演变为核碎裂、分散直至最后消失。电镜下亦可见肿瘤细胞膜及细胞器被破坏，核内染色质分散、边集。说明HIU能杀死门静脉癌栓中的癌细胞，可一次性将靶区内组织完全破坏达到对兔门静脉癌栓“切除”的目的。Yang等［12］曾对在体兔腹主动脉和下腔静脉进行HIFU实验(4 MHz，1 500 W/cm2,5 s)，因为大血管如腹主动脉管径粗，血液速度较快，存在血流散热作用，结果HIFU未造成血管损伤。 而Hynynen等［13］观察HIFU (1.49 MHz,≥5 800 W/cm2,1 s)对兔股动、静脉分支的作用时，发现可致血流停止，并有血管出血或破裂发生，原因在于低频、高强度超声照射时产生过强的空化效应引起，应避免发生。我们在采用HIU(10 MHz，45.86 W/cm2,30 s×5次)治疗门静脉癌栓过程中为防止过快的血流散热作用，人为暂时阻断门静脉血流，以求达到更满意的破坏肿瘤的效果。虽然HIU治疗后门静脉压较治疗前无明显降低，但亦未发现门静脉压升高，同时实验中未发生血管出血、破裂及闭塞等现象，亦说明HIU治疗门静脉癌栓的安全性可以得到保证。从生存时间来看，HIU组与HIU+ADM组的平均生存时间明显长于ADM组及对照组的平均生存时间(P<0.05)，HIU组与HIU+ADM组两组之间比较差异无统计学意义，ADM组与对照组比较差异也无统计学意义。因此可知，HIU或HIU+ADM治疗兔门静脉癌栓优于ADM组的疗效。HIU可造成肿瘤细胞膜通透性增加而使细胞内阿霉素聚积量增高, 从而增强阿霉素的细胞毒作用，这是二者协同效应产生的主要原因，对HIU治疗积极辅助化疗是一个支持。    总之，本实验初步证实了高强度超声治疗兔门静脉癌栓的有效性和安全性。能够完全覆盖并彻底杀死门静脉癌栓中的癌细胞，保持门静脉通畅，无门静脉出血，破裂等现象出现，为门静脉癌栓的治疗提供了一种新方法，为HIU治疗门静脉癌栓临床实验提供了基础实验依据，达到扩展HIU临床应用范围的目的。当然，HIU治疗与其他一些门静脉癌栓治疗方法一样，仅仅是一种局部治疗手段，仍应坚持综合治疗的原则，同时HIU治疗后的远期效果，包括降低局部复发率，预防远处转移的发生及延长生存期等问题尚有待于进一步的研究，以期获得满意的治疗效果。【参考文献】［1］ 王智彪，王芷龙，张哲，等.高强度聚焦超声致香猪胚胎急性不可逆损伤的电生理和形态学研究［J］.重庆医科大学学报校庆特刊,1996,21(T10):59-63.［2］ 范炜，罗世谯，李崇燕，等.免移植性门静脉癌栓模型的建立及生物学特性［J］.现代医药卫生，2005，21(13)：1626-1628.［3］ 王在国，刘光中，丁福全，等.原发性肝癌门静脉血流动力学研究新方法的建立及意义［J］.中国实用外科杂志,1997,17(10):601-602.［4］ Oosterhof G O, Cornel E B, Smits G A, et al. Influence of high intensity focused ultrasound on the development of metastases［J］. Eur Urol,1997,32(1):91-95.［5］ Prat F, Centarti M, Sibille A, et al. Extracoporeal highintensity focused ultrasound for VX2 liver tumor in the rabbit［J］. Hepatology,1995,21(3):832-836.［6］ Gelet A, Chapelon J Y, Bouvier R, et al. Preliminary results of the treatment of 44 patients with localized cancer of the prostate using transrectal focused ultrasound［J］. Prog Urology,1998,8(1):68-77.［7］ 叶明，王丽娟，付小龙, 等.加速超分割放疗结合化疗治疗非小细胞肺癌所致上腔静脉压迫综合征［J］.中华肿瘤杂志, 2001,23(5):426-427.［8］ Yoshimasu T, Oura S, Maebeya S, et al. Histoculture drug response assay on nonsmall cell lung cancer［J］. Gan To Kagaku Ryoho, 2000,27(5):717-722.［9］ Suzuki T, lnoue Y, Kuramochi A, et al. Squamous cell carcinoma and basal cell carcinoma［J］. Gan To Kagaku Ryoho, 1997,24(1):16-22.［10］Nishiyama K, Takahashi H, Okomoto M, et al. Combined chemotherapy and radiation therapy in head and neck cancer［J］. Acta Otolaryngol Suppl,1996,524:79-82.［11］张洪新，王友民，郭卫平，等.阿霉素化疗与热化疗对兔毛细血管VX2细胞体外作用的比较［J］.癌症,1999,18(3):276-279.［12］Yang R, Sanghvi N T, Rescorla F J, et al. Liver cancer ablation with extracorporeal highintensity focused ultrasound［J］. Eur Urol,1993,23(Suppl 1):17-22.［13］Hynynen K, Chung A H, Colucci V, et al. Potential adverse effects of highintensity focused ultrasound exposure on blood vessels in vivo［J］. Ultrasound Med Biol,1996,22(2):193-201.