肝糖原贮备对热缺血再灌注大鼠肝细胞凋亡的影响

肝糖原贮备对热缺血再灌注大鼠肝细胞凋亡的影响作者：陈文斌 陈永亮 卢灿荣 梁斌    作者单位：100853 北京，解放军总医院全军肝胆外科研究所    【摘要】  目的 探讨肝糖原贮备对热缺血再灌注肝细胞凋亡及肝损伤的影响。方法 建立大鼠肝热缺血模型。实验分组：术前24 h静脉注射25%葡萄糖组，2 ml/只，每6 h 1次，高糖饮食(H组)；术前禁食24 h，饮水不限(L组)；正常饮食对照组(N组)和假手术组(S组)。缺血45 min，再灌注2、24 h取材。流式细胞术检测细胞凋亡及Bcl2、Bax蛋白。同时进行肝酶学检测、肝组织形态学观察。结果 1.细胞凋亡及蛋白表达：(1)24 h细胞凋亡百分率。S组N组(P<0.01)。2.肝酶学指标：各时相点4组间比较差异有统计学意义(P<0.05)，S组    【关键词】  肝细胞凋亡 肝糖原 热缺血再灌注损伤 流式细胞术 大鼠    Effects of liver glycogen storage on hepatocyte apoptosis in rats with liver warm ischemia /reperfusion injury  CHEN Wenbin, CHEN Yongliang, LU Canrong, LIANG Bin, GAO Lijie. Institute of Hepatobiliary Surgery, General Hospital of PLA, Beijing 100853, China    【Abstract】  Objective  To study the role of hepatic glycogen storage in affecting hepatocyte apoptosis and liver injury in rats with liver warm ischemia/reperfusion injury. Methods  Models of liver warm ischemia/reperfusion injury (WIRI) in rats were set up and divided into Group H (injected with 25% glucose into tail vein for 2 ml, once per 6 and 24 hours before operation), Group L (fasting 24 hours before operation), Group N (normal diet control group) and Group S (sham operation group). After 45 minutes of ischemia and 2 and 24 hours of reperfusion, blood was taken to detect hepatocyte apoptosis, Bcl2 and Bax by flow cytometry and observe the changes of pathological morphology. Results  (1) Apoptosis rate at 24 hours in a increase order was from Group S, Group H, Group N to Group L (P<0.01), with apoptosis rate at 24 hours higher than that at 2 hours in all groups (P<0.01, except for Group S). Expression of Bcl2 in Group H at 24 hours was higher than that in other three groups (P<0.01), with expression of Bcl2 in Group L less than that in Group N (P<0.05). Expression of Bax in Group S at 24 hours was lower than that in other groups (P<0.01), with expression of Bax in Group L more than that in Group N (P<0.01). Expression of Bax at 24 hours was higher than that at 2 hours in all groups (P<0.01, except for Group S). (2) There was difference upon enzyme level in the same period among four groups (P<0.05), with level from least to highest in groups from Group S, Group H, Group N to Group L. (3) Pathological morphological changes after 24 hours of reperfusion in Group H was obviously slighter than those in Groups N and L, with the most significant change in Group L. Conclusion  Preventive increase of glycogen storage can relieve hepatocyte apoptosis and injury in the process of liver warm ischemia/reperfusion by modifying expressions of Bcl2 and Bax.    【Key words】  Hepatocyte apoptosis; Liver glycogen; Warm ischemia/reperfusion injury; Flow cytometry; Rats     肝脏热缺血再灌注损伤(warm ischemia and reperfusion injury,WIRI)过程中，细胞凋亡起重要作用。有研究［1-2］表明提高肝糖原贮备对肝脏WIRI过程中肝损害具有拮抗效应，但该机制尚不明确。本实验主要观察其中肝糖原对肝细胞凋亡的影响。1  材料与方法    1.1  材料    Wistar雄性大鼠，体重250～300 g，由解放军总医院动物实验中心提供。AST、ALT、AKP检测试剂盒购自南京建成生物工程所。鼠抗鼠Bcl2、Bax单克隆抗体购自Santa Cruz公司。羊抗鼠FITCIgG由军事医学科学院提供。流式细胞仪FACS420，美国BD公司产品。    1.2  方法    1.2.1  动物分组    Wistar雄性大鼠64只(体重250～300 g)，随机分组：①高糖原组(H组)：术前24 h开始尾静脉注射25%葡萄糖2 ml/只，每6 h 1次，共4次，自由饮食。②正常糖原组(N组)：自由饮食。③低糖原组(L组)：术前禁食24 h，饮水不限。以上各组进行实验时，动物麻醉后打开腹腔，无创血管夹夹闭肝蒂，45 min后打开血管夹并关腹，再灌注2、24 h后取材。④假手术组(S组)：开腹骚扰腹腔，但不夹闭肝蒂，自由饮食，余同前组。每组16只(按缺血再灌注时相2、24 h随机分为2个亚组，每组8只)。另取18只(6只尾静脉注射25%葡萄糖2 ml/次，每6 h 1次，饮食不限；6只禁食24 h，饮水不限；6只正常饮食)24 h后剖杀取肝组织，苦味酸纯酒精饱和甲醛溶液固定，行糖原染色。    陈文斌，等. 肝糖原贮备对热缺血再灌注大鼠肝细胞凋亡的影响  1.2.2  动物模型的制备    乙醚吸入维持麻醉，建立尾静脉输液通道，2 ml肝素(100 U/ml)尾静脉注射，生理盐水10 ml皮下注射。打开腹腔，无创血管夹夹闭肝蒂(S组除外)，并开始计时。肝蒂夹闭后肝脏颜色逐渐变深、肿胀、质地变硬，肠壁淤血。45 min后打开血管夹并关腹，再灌注2、24 h。    1.2.3  标本采集    按缺血再灌注时相点心腔取血，肝素抗凝，3000 r/min离心10 min，留取血清置于－20 ℃冰箱中保存待检，用于测AKP、ALT、AST。各组取血后立即切取肝组织2份，分别以10%中性甲醛、70%酒精固定备检。    1.3  指标检测    1.3.1  细胞凋亡及Bcl2、Bax蛋白检测    采用流式细胞技术进行。细胞凋亡采用溴化己啶染色法检测。Bcl2、Bax蛋白表达量采用细胞免疫荧光标记法检测。    1.3.2  肝脏酶学检测    血清AST、ALT及AKP酶测定按试剂盒说明进行。    1.3.3  病理组织学    所取肝组织行常规石蜡包埋切片，HE染色，置光镜下观察肝脏病理变化。    1.4  统计学处理    数据以±s表示，用SPSS 10.0软件，进行单因素方差分析q检验。2  结果    2.1  肝细胞凋亡率和Bcl2、Bax蛋白表达量    24 h细胞凋亡百分率：S组C组(P<0.01)，并且均高于前一时相点(P<0.01，S组除外)(表1、2)。表1  各组再灌注2、24 h肝细胞凋亡百分率表2  各组再灌注2、24 h Bcl2及Bax蛋白表达    2.2  血清AST、ALT及AKP检测结果    3种酶水平，各时相点4组间比较差异有统计学意义(P<0.05)，H组显著低于N组及L组(P<0.01)，高于S组(P<0.05)；L组明显高于S组(P<0.01)及N组(P<0.05)(表3)。    2.3  病理组织学改变    S组肝细胞组织结构形态正常(图1)。其余各组肝细胞出现不同程度胞质疏松化、细胞水肿、灶性细胞空泡变性(H组，图2)，以小叶中央区明显。汇管区有不同程度的炎性细胞浸润，部分肝细胞胞质的嗜酸性变较明显(N组，图3)。大片状溶解坏死，以小叶中央为著(L组，图4)。表3  再灌注2、24 h血AST、ALT、AKP浓度3  讨论    肝缺血再灌注损伤可引起细胞内促凋亡及抑制凋亡基因的表达改变，导致细胞凋亡，它是细胞死亡的一种主要方式［3-4］。其发生的可能原因主要有：(1)自由基损伤：肝WIRI过程中氧自由基大量堆积，直接损伤细胞或通过激发有关调控基因导致细胞凋亡；(2)肝细胞线粒体功能障碍所导致的质膜通透性改变是缺血再灌注后细胞凋亡的关键机制。总之，细胞凋亡在肝脏缺血再灌注过程中起着重要作用，其发生与氧自由基、细胞因子、能量代谢等有密切关系［5-6］。    本实验结果显示，再灌注早期(2 h)各组细胞凋亡率无明显差异。再灌注24 h时相点，H组、N组、L组的肝细胞凋亡率差异有统计学意义，呈增加趋势，形态学观察也证实该3组肝脏损伤逐渐加重。据此推断，细胞凋亡参与了此过程，而且糖原贮备丰富可抑制热缺血再灌注肝细胞凋亡；糖原贮备水平高则热缺血再灌注肝损害的程度轻。分析其可能原因是肝糖原贮备充足时可提高肝组织ATP含量，改善缺血再灌注过程中的能量危机，通过减少氧自由基，稳定肝细胞线粒体质膜等关键环节，抑制肝细胞凋亡，减轻肝损伤［7］。    有研究表明，Bcl2基因家族中有Bcl2亚家族、Bax亚家族和BH3亚家族，在缺血再灌注损伤中表现尤为突出，多数情况下Bcl2与Bax蛋白水平的高低与凋亡调控直接相关，Bax蛋白增高促进细胞凋亡，Bcl2增高抑制细胞凋亡［8-9］。这与本实验结果类似。Oshiro等［10］则发现Bcl2过度表达可促进凋亡。本实验发现，肝糖原高含量组(H组)再灌注过程中Bcl2表达量显著上调，而低糖原含量组(L组)Bax表达则明显升高，说明肝糖原缺乏与否可对Bcl2和Bax的表达产生了明显影响。这一结果提示肝糖原贮备水平与热缺血再灌注过程中肝细胞Bcl2、Bax表达量有一定相关性，其中是否具有确定的因果关系，尚需进一步探讨。    总之，预防性增加肝糖原贮备可抑制热缺血再灌注过程中肝细胞的凋亡，减轻肝损伤，其可能通过影响Bcl2、Bax的表达而发挥作用。【参考文献】［1］ 汤礼军,田伏洲,王雨,等.低温保存再灌注肝脏糖原含量与肝细胞凋亡的关系［J］.中华实验外科杂志,2002,19(2):154-155.［2］ 陈文斌，张瑞明，张笑春.肝糖原贮备的变化对热缺血再灌注期大鼠肝储备功能的影响［J］.中国普通外科杂志，2005,14(7)：490-496.［3］ Allal A S, Waelchli L, Brundler M A. 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