结直肠癌中DNA甲基化的研究进展

结直肠癌中DNA甲基化的研究进展作者：曹云飞 陈利生　    作者单位：530021 南宁，广西医科大学第一附属医院结直肠外科     结直肠癌是最常见的恶性肿瘤之一，是我国近年来发病率增长最快的肿瘤，其发生率增长了100%，现为第5位恶性肿瘤。过去认为结直肠癌发生是APC、kras、p53等基因突变累积使得正常结直肠上皮通过腺瘤演变为腺癌的结果。近来研究表明DNA的甲基化，不同于经典的基因突变，也是肿瘤发生的一种机制［1］。大多数结直肠癌中DNA的甲基化和一些经典的p53、kras等基因突变同时存在，而且许多基因如p14、p16、hMLH1等的启动子在结直肠癌中处于甲基化状态。本文将讨论近年来结直肠癌中DNA甲基化的一些研究进展。1  DNA甲基化和CpG岛    在人的基因组中，有70%的CpG二核苷酸处于甲基化状态。50%的基因的5'启动子富含CpG，且长度>197 bp的区域，这种区域被称为CpG岛。正常情况下，CpG岛处于非甲基化状态，结合该区域的特殊蛋白质对CpG岛有保护作用。    DNA的CpG岛甲基化对哺乳动物的发育非常重要，它在印迹基X染色体失活和基因组印迹等方面发挥重要作用。DNA甲基化还有减低转录噪音、防止转座子的启动、控制组织特异性基因表达等作用。肿瘤中，甲基化和抑癌基因的失活有关。    两种机制或许可以解释CpG岛甲基化引起的基因失活现象：一是甲基化的启动子和转录因子如AP2、CREB、E2F、NFκB和cMyc等的结合引起转录的抑制［2］；另一机制是甲基化的DNA结合蛋白如MeCP2、MBD1可抑制转录活性。这种情况下，基因表达的抑制依赖于甲基化的水平，该抑制通常是不可逆的［3］。当然，在这种CpG岛中，基因的失活还需要包括组氨酸修饰蛋白和其他蛋白组成的蛋白复合物的形成。2  结直肠癌中的DNA甲基化    对结直肠癌低甲基化的认识要早于高甲基化，和正常结直肠黏膜相比，结直肠癌基因组DNA处于低甲基化状态。有学者［4］认为DNA低甲基化使细胞的核型不稳定、促进杂合性缺失、突变发生率增加。低甲基化可引起癌基因如Ras、MDR1、NT、cmyc活化，参与肿瘤的发生。但是低甲基化和基因表达的关系并不明确，结肠息肉和侵袭性结肠癌的低甲基化程度无明显差别,似乎表明肿瘤低甲基化并未参与肿瘤的进展。因此,在结直肠癌中，DNA 低甲基化的功能仍然有待进一步阐明。    肿瘤组织的DNA整体上处于低甲基化状态，但是局部区域特别是启动子的CpG岛处于高甲基化状态。CALCA是较早发现的一个在结直肠肿瘤中CpG岛甲基化的基因［5］。CpG岛的甲基化是基因失活的重要机制。结直肠癌中P16INK4a的甲基化是目前已知的该基因失活的惟一机制。家族性腺瘤性息肉病中发生突变的APC基因和遗传性非息肉病性结直肠癌中发生突变的hMLH1基因在散发性结直肠癌中的失活也和基因启动子的甲基化有关。其他一些基因如HPP1/TPEF、RIZ1、HLTF等也是甲基化的靶基因。    一些癌基因比如COX2和hTERT也是DNA甲基化的靶基因。在肿瘤中抑癌基因甲基化的优势可能是因为肿瘤中抑癌基因甲基化的正性选择，而癌基因甲基化的负性选择的结果。3  结直肠癌中的CpG岛甲基化表型    有些基因如THBS1、HIC1、CALCA、p16等在正常的结肠黏膜不发生甲基化，仅在结直肠肿瘤中发生甲基化。通常这些基因的肿瘤相关甲基化是同时发生的，我们称之为CpG岛甲基化表型阳性(CIMP+)。在结直肠癌中，这个概念已经被公认，并且推广到肝癌、胃癌、胰腺癌等其他肿瘤中。    结直肠癌CIMP+的发生机制仍不清楚。CIMP+至少有两个特征,即好发在近端结肠,肿瘤分化较差，但肝转移几率较低。年龄相关的甲基化水平在左侧结肠肿瘤中较高，而结直肠癌CIMP+又好发于右侧结肠。因此，尽管年龄相关的甲基化水平在结直肠癌中较高，肿瘤相关的甲基化累及的抑癌基因更为重要，在结直肠癌发生发展过程中作用更大。    CIMP+结直肠癌分为以下两类：一类是高微卫星不稳定性表型(MSIH)，另一类伴随着高kras突变和低p53突变。MSIH型CIMP+结直肠癌MLH1启动子甲基化发生率较高，kras突变型CIMP和MGMT的失活有关，GA突变发生率较高［6］。4  年龄相关的甲基化    年龄是结直肠癌发生的一个重要因素，但是基因突变方面的研究并没有证实结直肠癌和年龄的关系。    第一个被认识和年龄相关的CpG岛甲基化基因是正常结肠上皮中的ERα基因。正常结肠黏膜的ERα基因的甲基化可以调节正常结肠上皮黏膜细胞的生长与分化，其甲基化水平随着年龄增加而增加。所有的结直肠肿瘤，包括微腺瘤都存在广泛的ERα基因甲基化，ERα甲基化发生水平最高的左半结肠，结直肠肿瘤发生率最高。IGF2、N33、MyoD和其他基因甲基化的水平也是随着年龄的增加而增加。    在正常的结直肠上皮细胞中，有些与年龄相关的基因甲基化水平较高。以亚硫酸盐为基础的测序方法分析微分离的结直肠隐窝发现，不同的隐窝甲基化模式不同，同一隐窝内部大部分甲基化模式是一致的［7］。这提示甲基化是结肠干细胞的一个特征。有研究表明，某些正常结肠上皮细胞中有高水平的MLH1［8］，在组织中出现了基因表达的变化［9］。    年龄相关的基因甲基化在结直肠癌中比较常见。结肠癌发生的最早期变化异常的隐窝有相当数量的基因甲基化［10］。在结肠癌发病率较高的溃疡性结肠炎患者中，相对正常的结肠上皮和异常结肠黏膜上皮的基因甲基化水平是对照组的3～5倍［11］。实际上，炎症或损伤状态下，细胞代谢的增加引起的甲基化增加也可能会导致肿瘤的发生率增加。此外，年龄相同，但年龄相关的基因甲基化不同提示环境暴露等因素影响着组织中甲基化的最后水平。5  结直肠癌中基因甲基化的临床应用    尽管5Fu为基础的化疗可以提高结直肠癌患者的无瘤生存率和总的生存率，但是该化疗方案的运用还存在许多争议。一些结直肠癌基因方面的研究成果还没有很好地运用到治疗中去，CIMP＋结直肠癌就是其中一个代表。    和酶反应一样，甲基化也是可以逆转的。DNA甲基化转移酶抑制剂AZA和脱氧类似物deAZA/decitabine就是两种抗甲基化药物。AZA能和DNA甲基转移酶1(DNMT1)结合形成共价复合物，使DNMT1失活，促进细胞分化和增殖抑制。目前在血液系统的肿瘤方面，正进行着Ⅱ期临床试验。低剂量的deAZA/decitabine被证明可以减少基因的甲基化，对白血病患者有一定的临床作用，但是其毒性和临床耐药性有赖于进一步观察。此外，去甲基化药物和组氨酸去乙酰化药物有协同作用。虽然deAZA能够克服耐药性，可以作为主要化学治疗的辅助措施，但是还没有研究证实靶基因的去甲基化和临床疗效之间的关系。    MGMT是一种DNA 修复酶,是对烷化剂类化疗药产生抗药性的主要因素。MGMT甲基化可能使肿瘤对烷化剂类化疗药如卡氮芥的反应较好［12］，脑胶质瘤的MGMT甲基化水平和结直肠癌类似，约40%［13］。在脑胶质瘤，MGMT甲基化和对卡氮芥的反应有明显关系［12］，MGMT甲基化可以作为预后的指标，缺少MGMT甲基化的脑胶质瘤患者的病死率是有MGMT甲基化患者的9.5倍。在其他有MGMT表达的肿瘤中，用O6benzylguanine等酶抑制剂，或许可以克服对卡氮芥的耐药性，减少毒性作用［14］。如果这些结果在结直肠癌可以重复,我们有必要根据肿瘤的分子特征重新评估结直肠癌的化疗方案。    功能正常的错配修复基因能帮助5Fu掺入DNA，引起细胞凋亡［15］。MMR的功能缺陷(比如由hMLH1启动子甲基化引起)可导致细胞对5Fu不敏感。CDNA甲基化与结直癌5Fu化疗的效果仍需进行大样本前瞻性随机研究。    异常的基因启动子甲基化多发生于肿瘤早期，一些患者的正常组织中也可以检测到。高水平的甲基化被认为和肿瘤的高危险性相关。实际上，在高龄人群、溃疡性结肠炎患者的结肠、病毒性肝炎患者的肝脏、吸烟人群的肺组织和Barret's食管等可以检测到非肿瘤组织的CpG岛的异常甲基化。正在进行的研究将会报道甲基化的测定在预测人群肿瘤发生率方面的应用。    肿瘤早期，在痰、血浆、尿液和大便等标本中也可以发现基因启动子的甲基化［16］，这为大多数肿瘤的早期诊断、危险评价和随访提供了一个非常有前景的方法。    尽管甲基化研究成果在肿瘤的防治工作中应用非常有前途，但是在未来的研究中还有一些问题需要解决。比如，甲基化抑制剂的应用会不会使正常细胞内的基因不适当的激活?因去甲基化治疗而引起的低甲基化会不会继发基因的不稳定性?安全性和有效性如何评价？6  小结与展望    在结直肠癌患者相对正常的黏膜中有和年龄相关的多个基因启动子甲基化，在肿瘤组织有和肿瘤相关的多个基因启动子甲基化，一系列基因的甲基化是结直肠癌的重要分子生物学标记。这些观察可使我们更好地了解结直肠肿瘤的生物学特性，并开创了结直肠癌流行病学、危险性评估和疾病治疗等方面新的领域。【参考文献】［1］ Jones P A, Laird P W. 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