层黏素受体下调对蛋白水解酶MMP2、 MMP9、uPA蛋白表达的影响

层黏素受体下调对蛋白水解酶MMP2、 MMP9、uPA蛋白表达的影响作者：李大江 陈健 陈长宏 王曙光　 作者单位：400038 重庆，第三军医大学西南医院全军肝胆外科研究所、中国人民解放军西南肝胆外科医院    【摘要】  目的 研究层黏素受体(LNR)反义硫代磷酸寡核苷酸片段(AsODN) 对人胆管癌QBC939细胞基质蛋白水解酶2(MMP2)、基质蛋白水解酶9(MMP9)以及尿激酶型纤维蛋白溶解酶原激酶(uPA) 蛋白表达的影响。方法 应用Western blotting分析浓度12 μmol/L的LNR AsODN作用48 h后，QBC939细胞MMP2、MMP9以及uPA 蛋白表达水平。结果 LNR AsODN能明显抑制人胆管癌细胞表达MMP2、MMP9以及uPA ,与对照组相比，MMP2、MMP9、uPA蛋白表达下降分别为21.8%、16.5%和9.0%(P<0.05)。结论 胆管癌细胞QBC939蛋白水解酶MMP2、MMP9以及uPA基因表达水平与层黏素受体的表达水平明显相关，LNR AsODN表达能够使胆管癌细胞蛋白水解酶基因表达下降，提示层黏素受体在介导胆管癌转移中发挥重要作用。    【关键词】  受体 层黏素 蛋白水解酶 胆管肿瘤 细胞系 寡核苷酸类 反义    Effect of downregulated laminin receptor of cell line QBC939 on protein expressions of MMP2, MMP9 and uPA  in human cholangiocarcinoma cells  LI Dajiang, CHEN Jian, CHEN Changhong, WANG Shuguang. Institute of Hepatobiliary Surgery & Southwest Hospital, Third Military Medical University, Chongqing 400038, China   【Abstract】  Objective  To investigate the effect of antisense oligodeoxynucleotide (AsODN) of laminin receptor (LNR) on expressions of matrix metalloproteinases2 (MMP2), MMP9 and uPA in human cholangiocarcinoma cells. Methods  Protein expressions of MMP2, MMP9 and uPA of cell line QBC939 were analyzed by using Western blotting after lipofectAMINE and AsODN phosphorothioate of LNR at concentrations of 12 μmol/L were cultured for 48 hours. Results  Western blotting showed that AsODN could significantly downregulate protein expressions of MMP2, MMP9 and uPap, with decrease rate of 21.8%, 16.5% and 9.0% respectively (P<0.05) in comparison with the control group. Conclusions  Gene expressions of MMP2, MMP9 and uPA are markedly related to expression of laminin receptor in cholangiocarcinoma cells and can be decreased by expression of LNR AsODN, suggesting an important role of laminin receptor in the invasion and metastasis of cholangiocarcinoma.   【Key words】  Cholangiocarcinoma; Cell line; Receptor, laminin; Oligodeoxynucleotides, antisense; Proteolytic enzyme    研究发现多种肿瘤细胞表面有层黏素的受体蛋白质——层黏素受体(laminin receptor, LNR)。LNR与包括卵巢癌、 乳腺癌、 肺癌等在内的多种肿瘤的转移能力密切相关［1-3］。基质金属蛋白水解酶2(metalloproteinase2，MMP2)、基质金属蛋白水解酶9(metalloproteinase9，MMP9)以及尿激酶型纤维蛋白溶解酶原激活物(urokinasetype plasminogen activator，uPA)是目前研究得较为广泛的蛋白水解酶。已证实它们参与了多种肿瘤的侵袭转移过程。我们通过运用反义技术，下调胆管癌细胞层黏素受体表达，观察其对MMP2、MMP9、uPA表达的影响。1  材料与方法    1.1  细胞培养    本实验所使用的细胞株(胆管癌QBC939细胞株)为第三军医大学王曙光教授［4］建立的高转移性亚群。在含10%小牛血清的RPMI1640培养基中，于37 ℃、5% CO2条件下培养，每72 h胰酶消化传代1次，取对数期的细胞用于本实验。    1.2  LNR反义寡核苷酸硫代修饰片段(AsODN)的合成    LNR AsODN序列为：5'GGCTCCGGACATTGTGAA3'(翻译起始区)。设空白对照组和顺义寡核苷酸组(SODN组)，后者序列为：5'TTCACAATGTCCGGAGCC3'(LNR cDNA序列)。以上寡核苷酸片段由上海生物工程有限公司合成，均为硫代磷酸型(即片段中的磷酸二酯键磷上的氧被硫取代)。    1.3  脂质体包裹寡核苷酸片段转染靶细胞    寡核苷酸和脂质体复合物在聚苯乙烯管中配制，脂质体lipofectAMINE(德国Boehringer Mannheim公司生产)介导的寡核苷酸细胞转染按产品说明书操作。取对数生长期的QBC939细胞，吸去培养液，无血清OptilMEM(Sigma公司生产)培养基洗1 次，寡核苷酸浓度分别为3、6、12μ mol/L，脂质体终浓度为3 μg/ml。37 ℃ CO2培养箱中孵育6 h后，再加入1 ml OptilMEM完全培养液继续孵育18 h,弃去OptilMEM、寡核苷酸和脂质体复合物，用2 ml DMEM完全培养基继续孵育48 h。对照组以不含寡核苷酸培养液处理。    1.4  流式细胞术检测LNR蛋白表达    实验分对照组、LNR AsODN组和SODN组3组。LNR AsODN组，又分为3、6、12 μmol/L 3个亚组；SODN组，又分为3、6、12 μmol/L 3个亚组。分别以0.25%胰酶、0.02%乙二胺四乙酸消化制成单细胞悬液。冷磷酸盐缓冲液(PBS)离心洗涤，弃上清，细胞重悬于100 μl LNR抗体稀释液中，37 ℃水浴1 h，抗体浓度为40 μg/ml。冷PBS离心洗涤2次，细胞重悬于1∶50稀释的荧光素异硫氰酸酯标记二抗100 μl，37 ℃水浴30 min。冷PBS离心洗涤2次，除去未结合的多余荧光抗体，最后重悬于500 μl PBS中，流式细胞计数仪(FACS440，USA)检测(4 ℃避光)。阴性对照不加一抗，余步骤相同。    1.5  Western blotting检测各处理组MMP2、MMP9、uPA的蛋白含量    按照分子克隆手册操作，提取细胞中的蛋白，SDSPAGE电泳和转印，PVDF膜采用硫酸镍胺增强显色。Gel Doc2000凝胶扫描系统上分析，蛋白含量以Volume值表示(Volume：OD×mm2)。    1.6  转染前后细胞侵袭实验    Transwell Polycarbonate Membrane Plates(美国Corning生产)，为上下室，中间滤膜孔径为8 μm。于下室中加入含趋化因子的无血清培养基,在膜上铺以matrigel 150 μl(120 μg，DMEM液稀释)，37 ℃下放置30 min。上室中加入保温1h的细胞悬液400 μl(细胞数2×105)，37 ℃、5% CO2条件下培养24 h。侵袭至滤膜下表面的细胞用苏木精伊红染色后，随机选择5个400倍显微视野，统计视野中的细胞数。以侵袭细胞的相对数目表示肿瘤细胞的侵袭能力。    1.7  统计学处理    统计资料表达采用±s，采用统计软件SPSS 13.0进行独立样本t检验。2  结果    2.1  流式细胞术检测细胞表面LNR表达    不同的寡核苷酸用量间的LNR表达差别见图1所示。LNR AsODN导入细胞后可下调细胞LNR的表达，且下调作用呈剂量依赖性。6 μmol/L组以上，LNR下调超过25%以上，与空白对照组及SODN组比较差异有统计学意义(P<0.05)。而SODN的导入对细胞LNR的表达无明显的抑制作用。    2.2  Western Blotting检测MMP2、 MMP9、 uPA蛋白12 μmol/L的LNR AsODN作用胆管癌QBC939细胞48 h后，Western Blotting测定胆管癌细胞MMP2、MMP9、uPA蛋白表达见图2。蛋白条带的灰度扫描值(OD×mm2)分别为1.432±0.311、3.026±0.132、2.102±0.237，明显低于正常对照组1.832±0.076、3.745±0.097、2.309±0.262(P<0.05)，下降幅度分别为21.8%、16.5%和9.0%。而SODN分别为1.749±0.167、3.870±0.094、2.262±0.126，SODN较之空白对照组差别不明显。    2.3  寡核苷酸转染后细胞侵袭能力    AsODN组细胞迁移数(78±6)个，显著低于对照组(105±11)个和SODN组(101±7)个，P<0.05。而SODN组与空白对照组比较差异无统计学意义。结果提示LNR下调的同时，伴有细胞浸润能力的下降。3  讨论    层黏素受体分为整合素及非整合素两大类。我们所研究的相对分子质量为67×103的层黏素受体属于非整合素受体类。相对与正常细胞，肿瘤细胞层黏素受体表达较高，并且与肿瘤的浸润转移恶性表形相关。层黏素及层黏素受体与肿瘤细胞的生长、黏附、迁徙、浸润及转移密切相关。在肿瘤浸润及转移的这一复杂过程中，肿瘤细胞至少3次与基底膜相互作用(黏着并破坏基底膜)。肿瘤细胞主要通过其表面的层黏素受体与基底膜中层黏素相互识别与结合来完成的。层黏素受体不仅仅作为一种黏附分子帮助细胞黏附，更重要的是接受并传导细胞外信息进入细胞。研究发现MAPK途径可能在其中发挥重要作用，包括ERKs、JNK、p38 MAPK等，参与基因表达的调节，影响细胞外基质的降解，从而增强肿瘤细胞的浸润和转移［5-6］。由此可见，LNR不仅是维持正常细胞重要的生理功能的细胞表面的受体分子，而且亦可能是肿瘤侵袭和转移过程中的关键因子。    MMP是一类锌离子依赖性蛋白水解酶，可降解细胞外基质，为肿瘤的浸润和转移提供必要条件。MMP2、MMP9又称胶原酶，作用底物为细胞外基质的主要成分Ⅳ型胶原纤维组织，在肿瘤的浸润和转移中起着重要作用。uPA属于丝氨酸蛋白酶类,它能使纤溶酶原激活成为纤溶酶，导致细胞外基质和基底膜成分的降解，促进肿瘤细胞发生侵袭、转移［7］。    我们以往的研究证实在胆管癌QBC939细胞存在有MMP2、MMP9及uPA的高表达，而且也发现uPA及其作用产物纤维蛋白溶酶抑制剂反对氨甲基环己酸和6氨基己酸可抑制QBC939细胞uPA的活性，并显著抑制其体外浸润能力［8］。我们最近的研究表明，LNR AsODN导入细胞后可下调细胞LNR的表达，且下调作用呈剂量依赖性，下调胆管癌细胞层黏素受体表达，能抑制胆管癌细胞MMP2、MMP9及uPA mRNA的表达水平［9-10］。本实验进一步观察到LNR AsODN能明显抑制人胆管癌细胞表达MMP2、MMP9以及uPA蛋白的表达，12 μmol/L的LNR AsODN作用胆管癌细胞48 h后，Western blotting检测QBC939细胞MMP2、MMP9以及uPA蛋白下降幅度分别为21.8%、16.5%和9.0%(P<0.05)，并伴有细胞体外侵袭能力的下降。由此推测，肿瘤细胞上的LNR与细胞外基质中层黏连蛋白等的结合后，其结合的信号可以通过激活细胞内MAPK信号传导通路，从而影响蛋白水解酶MMP2、MMP9及uPA的基因表达。肿瘤细胞过度表达的LNR可能通过激活蛋白水解酶的表达而促进细胞外基质的降解,从而促进肿瘤细胞的转移，而通过转染LNR AsODN，下调肿瘤细胞LNR的表达，可以降低肿瘤细胞蛋白水解酶的表达，从而抑制了肿瘤的浸润能力。【参考文献】  ［1］ GivantHorwitz V, DavidsonB, van de Putte G, et al. Expression of the 67 kDa laminin receptor and the alpha6 integrin subunit in serous ovarian carcinoma［J］. Clin Exp Metastasis,2003,20(7):599-609.  ［2］ Molino A, Pedersini R, Micciolo R, et al. Prognostic significance of laminin, laminin receptor, and bone marrow micrometastases in breast cancer patients: are these markers of aggressive behavior and metastatic potential［J］? Appl Immunohistochem Mol Morphol,2003,11(4):311-318.  ［3］ Takenaka K, Shibuya M, Takeda Y, et al . Altered expression and function of beta1 integrins in a highly metastatic human lung adenocarcinoma cell line［J］. Int J Oncol,2000,17:1187-1194.  ［4］ 王曙光，韩本立，段恒春，等.肝外胆管癌细胞系的建立［J］.中华实验外科杂志，1997，14(2)：67-68.  ［5］ Molino A, Pedersini R, Micciolo R, et al. Prognostic significance of laminin, laminin receptor, and bone marrow micrometastases in breast cancer patients: are these markers of aggressive behavior and metastatic potential［J］? Appl Immunohistochem Mol Morphol,2003,11(4):311-318.  ［6］ Givant Horwitz V, Davidson B, Reich R, et al. Laminininduced signaling in tumor cells: the role of the M(r) 67,000 laminin receptor［J］. Cancer Res,2004,64(10):3572-3579.  ［7］ Del Rosso M, Fibbi G, Pucci M, et al. Multiple pathways of cell invasion are regulated by multiple families of serine proteases［J］. Clin Exp Metastasis,2002,19(3):193-207.  ［8］ 王曙光，韩本立，段恒春，等.尿激酶型纤维蛋白溶酶原激活物在胆管癌浸润中的作用［J］.中华医学杂志,1996;76(8):594-596.  ［9］ 王曙光，陈长宏，李大江，等.胆管癌细胞层黏连蛋白受体表达下调对蛋白水解酶尿激酶型纤维蛋白溶解酶原激酶mRNA表达的影响［J］.中华医学杂志，2004,84(19):1642-1644.  ［10］陈长宏，王曙光，李大江,等.胆管癌细胞层黏连蛋白受体表达下调对蛋白水解酶MMP2、MMP9 mRNA表达的影响［J］.解放军医学杂志，2002,27(5):423-425.