TK GCV、CD 5Fc双自杀基因系统治疗结肠癌的实验研究

TK GCV、CD 5Fc双自杀基因系统治疗结肠癌的实验研究作者：魏冬 韦军民 黄美雄 何庆泗 苏伟　    作者单位：100730 北京，卫生部北京医院普外科     【摘要】  目的 观察胸苷激酶/丙氧鸟苷(TK/GCV)、胞嘧啶脱氨酶/5氟胞嘧啶(CD/5Fc)双自杀基因系统对结肠癌的治疗效果，并结合研究结果进行作用机理的分析。方法 采用培养细胞移植法，将人结肠癌细胞系SW480接种于裸鼠背部皮下，建立裸鼠人结肠癌移植瘤模型。将32只裸鼠随机分为4组：空白对照组，TK/GCV治疗组，CD/5Fc治疗组，TK/GCV+CD/5Fc联合治疗组，每组8只。TK/GCV+CD/5Fc采用逆转录病毒介导，采用瘤体内直接注射法，同时腹腔注射GCV、5Fc治疗，观察各组小鼠的生存状况及肿瘤体积、瘤重、肿瘤生长抑制率、常规病理、生存期等指标，比较观察各治疗组的治疗效果及对荷瘤裸鼠存活的影响。结果 各治疗组裸鼠人结肠癌移植瘤的生长均受到显著抑制，治疗后各组体积数增加(P<0.05)，治疗组裸鼠存活期显著延长，TK/GCV+CD/5Fc联合治疗组效果最好，疗效q值=1.675>1.15，即TK/GCV、CD/5Fc有交互协同作用。结论 TK/GCV与CD/5Fc对人结肠癌SW480细胞有明显抑制作用，TK/GCV、CD/5Fc双自杀基因系统效果更强。     【关键词】  肠肿瘤 双自杀基因系统 胸苷激酶 丙氧鸟苷 胞嘧啶脱氨酶 5氟胞嘧啶 小鼠     Treatment of human colocarcinoma with gene therapy system of TK/GCV and CD/5Fc in nude mice  WEI Dong, WEI Junmin, HUANG Meixiong, HE Qingsi, SU Wei. Department of General Hospital, Beijing Hospital, Ministry of Health, Beijing 100730, China    【Abstract】  Objective  To investigate the curative effect of the system of TK/GCV and CD/5Fc on colocarcinoma and analyze the corresponding mechanism. Methods  By using transplantation of the cultivated cells, human colocarcinoma cell line SW480 was injected subcutaneously on the back of nude mice to establish the animal model of human colocarcinoma. Thirtytwo nude mice were divided randomly and equally into four groups, ie, control group, TK/GCV group (group TK), CD/5Fc group (group CD) and group of system of TK/GCV and CD/5Fc (group TKCD). TKCD mediated by the reverse transcription virus was injected directly into the tumor. At the same time, the nude mice were given intraperitoneal injection of GCV and 5Fc nude for observing parameters including common status, tumor bulk, tumor weight, inhibition rate of tumor growth, pathology and survival period of mice and comparing treatment effect and survival rate in each group. Results  Tumor growth was obviously inhibited in each treatment group, especially in  group of system of TK/GCV and CD/5Fc, with tumor bulk in control group, group TK, group CD and group TKCD for (2.618±0.223) cm3, (2.156±0.242) cm3, (2.044±0.191) cm3 and (1.052±0.173) cm3 respectively (P<0.05). The survival period was significantly prolonged to (54.3±6.5) days，(68.7±6.0) days, (69.7±3.5) days and (79.3±4.7) days in control group, group TK, group CD and group TKCD respectively (P<0.05). There was mutual effect between TK/GCV and CD/5Fc (q=1.675>1.15). Conclusion  TK/GCV and CD/5Fc can obviously inhibit the growth of human colocarcinoma cell line SW480 and the combined genes exert greater antitumoral effect.    【Key words】  Colocarcinoma; System of TK/GCV and CD/5Fc; Thymidine kinase; Ganciclovir; Cytosine deaminase; 5fluorocytosine;  Mice     结肠癌是我国常见的恶性肿瘤之一，其发病率呈上升趋势。对结肠癌的深入研究是我国肿瘤研究的重要课题。肿瘤的基因治疗正由实验研究走向临床，自杀基因治疗作为一种新兴的基因治疗方法，可能成为一种临床应用极具潜力的治疗手段。目前，胸苷激酶/丙氧鸟苷 (TK/GCV)系统和胞嘧啶脱氨酶/5氟胞嘧啶(CD/5Fc)系统在自杀基因的研究中应用较多。为了进一步探讨TK/GCV、CD/5Fc双自杀基因系统用于人结肠癌基因治疗的可能性，本课题通过建立SW480裸鼠移植瘤模型，在动物试验中应用TK/GCV、CD/5Fc对人结肠癌进行治疗，观察TK/GCV、CD/5Fc双自杀基因系统治疗结肠癌的效果，证实其有效性，并探讨其作用机理，为结肠癌联合基因治疗提供新的思路和可靠的实验证据。1  材料与方法    1.1  裸鼠结肠癌移植瘤模型的建立    采用培养细胞移植法［1］，应用上海生物细胞研究所建立的人结肠癌细胞系SW480，于RPMI1640含新生牛血清和双抗的培养液中，37 ℃恒温孵育，获得生长达80%汇合的SW480细胞，收集细胞并制成5×107/ml的细胞悬液，接种于裸鼠(SPF级BALB/C Anu品系，4周龄，体重16～20 g，雌性)背部皮下，0.2 ml/只，待肿瘤长至0.5 cm3左右时，开始基因治疗。　  1.2  分组与给药    将荷瘤裸鼠随机分为4组(每组8只)：①空白对照组；②TK/GCV治疗组：山东大学齐鲁医院肿瘤中心实验室提供PA317/TKCD细胞，采用逆转录病毒介导，1×109 PFU瘤内注射，每天1次，连续3 d，注射后48 h，开始腹腔注射GCV 100 mg·kg-1·d-1，连续10 d；③CD/5Fc治疗组：1×109 PFU瘤内注射，每天1次，连续3 d，注射后48 h，开始腹腔注射5Fc 500 mg·kg-1·d-1，连续10 d；④TK/GCV+CD/5Fc联合治疗组：1×109 PFU瘤内注射，每天1次，连续3 d，注射后48 h，开始腹腔注射GCV 100 mg·kg-1·d-1， 5Fc 500 mg·kg-1·d-1， 连续10 d。    1.3  疗效观察    (1)每天观察小鼠的生存状况及肿瘤生长情况。(2)肿瘤体积：基因治疗开始后记为第1周，用游标卡尺每周测量肿瘤的长径L，短径R，按V=1/2(LR2)计算肿瘤体积，连续7周。并根据体积绘制各组肿瘤生长曲线。(3)肿瘤生长抑制率：E=(对照组平均肿瘤体积增长数-治疗组平均肿瘤体积增长数)/对照组平均肿瘤体积增长数×100%。计算q值=E4/［E2+E3(1-E2)］，E2、E3、E4分别为TK/GCV治疗组、CD/5Fc治疗组、TK/GCV+CD/5Fc联合治疗组的肿瘤生长抑制率，根据q值来判断联合用药的疗效：q值<0.85为拮抗，0.85～1.15为相加，>1.15为协同。(4)瘤重：基因治疗完成后，即从第3周开始，每周每组脱颈处死1只裸鼠,用电子天平称量瘤重，连续5周。剩余小鼠留做生存期的观测。(5)解剖并观察转移情况。(6)形态学观察：大体形态及光镜观察肿瘤组织的病理变化。(7)生存期：从基因治疗完成后算起，并计算各治疗组的生命延长率=(治疗组平均存活时间-对照组平均存活时间)/对照组平均存活时间×100%［2］。    1.4  统计学处理    采用方差分析处理实验数据，采用最小显著差(LSD)t检验进行每两组间差异显著性的检验，采用2×2析因分析检验TK/GCV、CD/5Fc双自杀基因系统是否存在交互协同作用。统计处理应用SPSS 11.0统计软件包。2  结果    2.1  小鼠的生存状况及肿瘤生长情况    对照组裸鼠移植瘤实验过程中部分出现表面坏死、破溃感染，后期有恶病质表现。治疗组治疗过程中移植瘤表面光滑完整，裸小鼠无恶病质表现，一般情况、食欲、精神状态及皮肤反应均无改变。    2.2  肿瘤体积    各组肿瘤体积生长曲线见图1。第7周较第1周的体积增加数均值分别为：空白对照组(2.618±0.223)cm3，TK/GCV治疗组(2.156±0.242)cm3，CD/5Fc治疗组(2.044±0.191)cm3，TK/GCV+CD/5Fc联合治疗组(1.052±0.173)cm3。方差分析及最小显著差(LSD)t检验表明，各组间比较差异有统计学意义(P<0.05)。即各治疗组对抑制肿瘤的增长均有显著意义，TK/GCV+CD/5Fc联合治疗组效果最强。    2.3  各治疗组的肿瘤生长抑制率    根据第7周的体积增长结果：E2 17.7%，E3 21.9%，E4 59.8%%。联合基因治疗的疗效q值=1.675>1.15。说明TK/GCV、CD/5Fc有协同作用。    2.4  瘤重    4组裸鼠第3～7周瘤重见表1。表1  4组裸鼠第3～7周瘤重    2.5  转移情况    肉眼及病理证实对照组裸鼠有淋巴结及肝、肺转移。治疗组每只裸鼠的心、肝、肺、脑、肾等重要脏器未见转移灶，淋巴结无转移。    2.6  形态学观察(第7周)    大体形态：肿瘤类圆形，无明显包膜，表面尚光滑，个别瘤体表面有破溃，肿瘤切面为实性，灰白色，部分区域有黄白色豆渣样组织。光镜观察：对照组肿瘤细胞呈圆形或多边形，胞核圆形，居中，核分裂象多见。未见明显区域性坏死组织，肿瘤细胞成片生长，肿瘤细胞排列有规律，核大、深染、核分裂象增多及胞质少，看不到纤维组织增生及炎细胞浸润，仅有小灶状凋亡。治疗组有坏死组织，可见凋亡细胞，细胞体积缩小，胞质和核固缩，核碎裂、溶解，可见凋亡小体。TK/GCV治疗组、CD/5Fc治疗组的裸鼠肿瘤组织显示小部分区域肿瘤细胞坏死；TK/GCV+CD/5Fc联合治疗组可见大部分区域肿瘤细胞变性坏死，肿瘤细胞结构不清，为增生的纤维组织所代替，在坏死的组织中可以见到巨噬细胞浸润(图2)。    图2  4组裸鼠第7周肿瘤组织病理切片  (HE  ×400)    A：空白对照组，肿瘤细胞呈圆形或多边形，核圆，居中，核分裂象多见； B：TK/GCV治疗组，肿瘤细胞坏死，可见凋亡小体； C：CD/5Fc治疗组，肿瘤细胞坏死，可见凋亡小体； D：TK/GCV+CD/5Fc联合治疗组，肿瘤细胞变性坏死，结构不清，纤维组织增生，可见巨噬细胞    2.7  生存期    方差分析及最小显著差(LSD)t检验表明，各组间差异有统计学意义(P<0.05)(表2)。即各治疗组均能显著延长裸鼠生存期，联合基因治疗组效果更明显。各治疗组的生命延长率：TK/GCV治疗组26.5%，CD/5Fc治疗组28.4%，TK/GCV+CD/5Fc联合治疗组46.0%。    表2  4组裸鼠生存期(t/d)    组别n生存期(d/只)平均生存期(±s)1348,54,6154.3±6.52363,68,7568.7±6.03366,70,7369.7±3.54374,81,8379.3±4.73  讨论    本课题成功地建立了SW480裸鼠移植瘤模型，在动物试验中应用TK/GCV、CD/5Fc双自杀基因系统对人结肠癌进行了有效地治疗，并结合研究结果进行作用机理的分析，为未来结肠癌的基因治疗提供了新的思路和可靠的实验证据。目前，恶性肿瘤自杀基因治疗中，TK/GCV和CD/5Fc系统应用最多［3］。单自杀基因治疗肿瘤存在不足之处，TK/GCV+CD/5Fc双自杀基因联合应用较单一自杀基因具有更强的抗肿瘤作用及旁观者效应［4］。本研究结果充分证实了这一点。    本课题的研究结果表明，TK/GCV系统和CD/5Fc系统对人结肠癌SW480细胞均有明显抑制作用。以下对其作用机理进行分析：TK基因是编码脱氧胸苷激酶的基因，该酶的主要功能是催化脱氧胸苷(dThd)变成脱氧胸苷酸(dTMP)，后者在细胞内酶的作用下成为有毒性的三磷酸化物，抑制DNA多聚酶并竞争性的掺入细胞DNA链中，使DNA链破碎，杀死细胞而发挥抗肿瘤作用。而GCV为目前TK基因治疗最常用的药物。CD基因即胞嘧啶脱氨酶基因，其表达蛋白CD即胞嘧啶脱氨酶催化胞嘧啶脱氨基生成尿嘧啶，使低毒性的5Fc变成了强毒性的化疗剂5氟尿嘧啶(5Fu)。自杀基因还有其特有的旁观者效应(bystander effect)，使其能更多更有效地杀死肿瘤细胞。该现象的机理有如下几种假说：(1)缝隙连接机制。失去接触抑制的肿瘤细胞之间通过缝隙连接交换毒性代谢产物即磷酸化的GCV，从而引起HSVTK阴性的肿瘤细胞的死亡。Asklund、Matono等［5-6］的研究均证实了这一点。(2)细胞凋亡机制。与细胞的程序性死亡过程有关。(3)免疫介导机制。动物实验发现单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSVTK)阳性肿瘤细胞被GCV杀伤后，可以引起坏死组织周围大量巨嗜细胞和CD+4、CD+8T淋巴细胞的浸润［7］，强烈炎症反应可引起抗肿瘤免疫性杀伤。(4)肿瘤缺血坏死。经GCV治疗后，肿瘤内血管减少，肿瘤因发生缺血性坏死而迅速消失。CD基因治疗途径比TK/GCV治疗途径的旁观者效应更强，有一点较为明确，5Fu可以自由穿过细胞膜，从CD阳性细胞传递到CD阴性细胞造成后者死亡。    我们研究发现，TK/GCV+CD/5Fc双自杀基因系统能更有效的抑制人结肠癌SW480细胞的生长，且两者有交互协同作用。双自杀基因疗法是利用基因工程的技术将两种自杀基因整合在一起，通过载体转导入肿瘤细胞，使其在肿瘤细胞内表达融合基因产物，此产物具有两种自杀基因编码的酶的活性，然后给予双前体药物治疗，从而对两类不同的前体药物敏感，而发挥双功能的杀伤作用。利用两类自杀基因疗法互补的作用，可以大大提高其应用价值而不必考虑自杀基因疗法的肿瘤细胞类型依赖性，同时可以最大限度消除肿瘤细胞对治疗药物的耐药性。Chang、Desaknai等［8-9］对胶质瘤的研究充分证明了双自杀基因治疗的优越性。    自杀基因最早、最广泛的应用于肿瘤的基因治疗中，有些已经进入一期临床试验［10］。双自杀基因等多种疗法的出现为治疗晚期结肠癌的转移、复发，改善患者生活质量，延长生存时间，甚至治愈肿瘤开辟一个崭新的空间。【参考文献】  ［1］ 魏泓.医学实验动物学［M］.成都：四川科学技术出版社,1998：423-427.  ［2］ 晏子厚,荣祖元,何菊,等.治疗用卡介苗抗肿瘤动物实验方法的建立［J］.中国生物制品学杂志,2002,15(6)：363-365.  ［3］ Sandalon Z, Fusenig N E, McCutcheon J, et al. 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